嗜热基因打靶系统Thermotargetron构建及其打靶效率检测

[目的]在大肠杆菌中构建基于嗜热Ⅱ型内含子的高效Thermotargetron基因打靶系统,并验证其温度敏感性及打靶效率,为嗜热Ⅱ型内含子功能分析建立快速遗传检测平台。[方法]首先,以大肠杆菌lacZ基因为靶基因,根据嗜热Ⅱ型内含子碱基识别规律设计基因打靶引物,构建IPTG诱导型Thermotargetron打靶载体。然后,利用蓝白斑筛选及菌落PCR方法检测其打靶效率,并通过优化温度、IPTG浓度及诱导时间,确定Thermotargetron在大肠杆菌中的最佳打靶条件。[结果]在大肠杆菌正常生理条件下,Thermotargetron不具有基因打靶功能,而在45℃及以上条件下可获得较好的打靶效率,且在48℃、1.0 mmol/L IPTG诱导5 h时在lacZ-369a、lacZ-60a、lacZ-515a三个位点的打靶效率分别达到98.05%±1.67%、91.76%±7.08%和69.77%±5.86%。[结论]在短暂耐高温的大肠杆菌中建立了IPTG诱导的Thermotargetron基因打靶系统,该系统在任意选择的3个靶位点的打靶效率平均为86.5%±12.1%,为嗜热Ⅱ型内含子的功能机制研究奠定了平台基础。

大肠杆菌fliC基因失活突变株的构建及其特征

构建编码大肠杆菌鞭毛蛋白基因(fliC)失活突变株,并探究其生物被膜形成改变后在应激状态下的生物学特征。使用Thermotargetron靶向基因失活系统,构建fliC基因失活突变株(ΔfliC420s),测定ΔfliC420s与野生型菌株的生长速率、运动能力、生物被膜形成能力、自溶速率、pH敏感性及对抗生素耐受性的变化。ΔfliC420s相比野生型菌株,生长速率未受影响,在半固体培养基中运动能力缺失,生物被膜形成能力明显降低,菌体自溶速率加快,pH敏感性增强,以及对D-环丝氨酸、红霉素、诺氟沙星的耐受性降低。大肠杆菌fliC基因在细菌生物被膜形成和对外界压力的抵抗中具有重要作用。

大肠埃希菌密度感应调节子qseC基因失活突变株构建及其生物学特性

目的密度感应系统与细菌生长状态、毒力改变、生物膜形成、运动能力改变以及参与细菌和宿主的免疫反应和对药物的抗性等相关。大肠埃希菌密度调节子C(Escherichia coli quorum sensing regulator C,qseC)是其密度感应系统的受体,探究其对大肠埃希菌生理、生化特征的影响。方法使用嗜热二型内含子基因打靶系统(Thermotargetron)构建大肠埃希菌HMS174菌株qseC基因失活突变株,测定其生长速率、溶血能力、生物膜形成和运动能力等表型的变化,以及对酸碱和6种抗生素的敏感性。结果成功构建了大肠埃希菌HMS174 qseC627s位点的打靶载体,该载体基因失活效率为100%。对比大肠埃希菌HMS174与ΔqseC627s突变株的表型发现,突变株生长速率和最大生物量降低、溶血能力丧失、生物膜形成能力降低、运动能力减弱、对酸、碱的耐受能力降低。抗生素敏感性测定结果表明,ΔqseC627s对氯霉素、氨苄青霉素、四环素、阿莫西林、甲硝唑耐受性降低。结论大肠埃希菌HMS174中qseC基因缺失后,突变株表型和对抗外界压力因素发生了显著改变。

嗜热Ⅱ型内含子Tel3c/4c-RT结构域活性位点分析

【背景】嗜热Ⅱ型内含子是一类由内含子RNA和内含子编码蛋白(intron encoded protein,IEP)组成且在高温条件下能够在染色体上高频移动的反转录转座子,目前已被开发为高效基因打靶工具Thermotargetron,阐明其活性催化位点,对深入研究其“归巢”机制及开发新型遗传工具具有重要意义。【目的】筛选嗜热Ⅱ型内含子Tel3c/4c-RT结构域关键活性位点,并获得失活反转录功能的内含子编码蛋白突变体。【方法】先利用生物信息学技术分析并筛选可能影响Tel3c/4c-RT反转录功能的关键氨基酸位点;然后对筛选到的关键氨基酸位点进行定点突变,并以Thermotargetron质粒为基础构建失活反转录功能的突变型嗜热Ⅱ型内含子打靶系统;最后以大肠杆菌lacZ基因为例,通过蓝白斑计数分析突变型Thermotargetron系统的打靶效率,体内验证Tel3c/4c-RT结构域关键活性位点突变对嗜热Ⅱ型内含子打靶效率的影响。【结果】共筛选到15个可能影响反转录活性的氨基酸位点,包括D194、I195、S196、G197、C198、F199、Q241、G242、R274、Y275、A276、D277、D278、L324和G325。其中,当G242和R274这2个位点突变后,嗜热Ⅱ型内含子Tel3c/4c的“归巢”效率几乎完全丧失,表明G242和R274是影响嗜热Ⅱ型内含子Tel3c/4c-RT结构域反转录功能的最核心催化位点。【结论】筛选并获得影响嗜热Ⅱ型内含子Tel3c/4c-RT结构域反转录功能的关键催化位点,为深入研究嗜热Ⅱ型内含子的“归巢”机制及其功能应用开发奠定了良好的基础。

温度诱导Targetron系统用于大肠杆菌高效基因失活

构建基于Te I3c/4c嗜热二型内含子的温度诱导Targetron基因失活系统(Thermotargetron),并应用于中温微生物基因编辑。在大肠杆菌HMS174(DE3)基因组中,选择Subunitofflagellum基因(fliC)和C4dicarboxylate orotate:H+symporter基因(dctA)为靶基因。根据Te I3c/4c DNA识别规则,在fliC和dctA基因中选择fliC489a、fliC828s、fliC1038s和dctA2a位点为基因打靶位点。使用重叠延伸PCR方法,基于pHK-TT1A质粒构建打靶载体。打靶载体转化HMS174菌株,对数期转化子培养液48℃热激1h后涂布于氯霉素抗性LB平板上。使用菌落PCR和DNA测序检测突变株并计算基因失活效率。获得突变株后,通过琼脂穿刺和碳源代谢实验,鉴定ΔfliC、ΔdctA突变株表型变化。菌落PCR测序结果表明,Te I3c/4c插入到fliC和dctA基因设计位点,且打靶效率高达100%。突变株表型验证实验表明,ΔfliC突变株运动能力显著下降,ΔdctA突变株苹果酸代谢能力缺失。综上所述,文中建立了一套适用于嗜中温微生物的温度诱导型、高效基因失活系统,该系统可通过控制宿主菌在48℃保温时间实现高效、靶向、精准基因失活。