基于G-四链体/硫黄素T无标记荧光适配体传感器快速检测氟苯尼考

硫黄素T(ThT)通过非共价相互作用与G-四链体结合,形成G-四链体/ThT复合物,呈现出较强荧光强度,而游离ThT荧光十分微弱。当存在氟苯尼考(FF)时,具有G-四链体结构的适配体(Apt)对靶标的高亲和力,使得Apt/FF复合物形成并释放ThT,荧光强度降低。基于这一特点,本研究设计一种灵敏快速的现场检测体系,用于检测氟苯尼考,即基于G-四链体/硫黄素T的无标记荧光适配体传感器。该适配体传感器的检测范围为0.0128~200 ng/mL,实际检出限0.0128 ng/mL,检测总时长10 min。同时,对实际加标样品(牛奶和鸡蛋)进行回收率计算,加标回收率在91.2%~117.1%之间。所建立的无标记荧光适配体传感器具有高特异性、成本低、耗时短等优点,可用于实际样品的现场检测。

PCR可视化检测技术的开发及其在猪源性检测中的应用

该文以G-四链体和硫磺素T为报告体系,建立一种聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)可视化检测方法,仅需普通基因扩增仪和蓝光灯,即可在反应后通过肉眼观测荧光亮度直接判读结果,无需开盖,避免PCR产物污染问题的发生。并以猪源性DNA为检测目标设计特异性引物,建立猪源性可视化检测方法,通过对市售的牛、羊、兔、鸡、鸭肉对比,特异性良好,检测限达到0.01 ng/μL,可在混合肉DNA样品中检出1%的猪肉,并且能成功应用到实际食品样本的检测中。反应时间可控制在1 h以内,相较常用的实时荧光PCR,该方法既缩短时间,又不需要使用更昂贵的荧光PCR仪,且无需荧光基团修饰的探针,适合在简单的条件下进行快速定性检测。

基于ThT荧光寿命检测蛋清溶菌酶蛋白寡聚体

采用时间分辨荧光技术,检测了不同形态蛋白聚集体的荧光染料硫磺素T(ThT)荧光寿命.利用蛋清溶菌酶体外制备了蛋白聚集体;采用透射电子显微镜(TEM)及ThT稳态荧光检测了结合蛋白纤维生长的动力学曲线,确定其形成寡聚体及纤维样聚集体的特征和时间.通过时间相关单光子计数(TCSPC)技术测定了蛋清溶菌酶单体、寡聚体和淀粉样纤维的ThT荧光寿命曲线,并拟合、计算其荧光寿命.根据圆二色谱(CD)分析结果推测聚集体的结构不同导致其与ThT的结合状态不同,从而影响ThT荧光寿命.结果表明,通过测定ThT荧光寿命可以区分蛋白单体、寡聚体和纤维样聚集体,并监测蛋白寡聚体的形成,为后续病理蛋白聚集过程中形成寡聚体物质的监测提供了研究基础.

基于碳点与硫黄素T之间的内滤光效应测定Cu(Ⅱ)

本文以柠檬酸（Citric Acid,CA）为碳源,聚乙烯亚胺（Branched Polyethylenimine,BPEI）为钝化剂,采用水热法合成了高荧光量子产率的碳点（Carbon Dots,CDs）。使用紫外-可见光谱、红外光谱、荧光光谱及原子力显微镜等对制得的CDs进行表征。制备的CDs粒径分布均匀,主要在3-6nm之间,量子产率为39.8%。由于CDs的发射光谱和硫黄素T（Thioflavin T,ThT）的激发光谱有很大程度的重叠,基于荧光内滤效应构建了测定Cu（Ⅱ）的BPEI-CDs/ThT体系,该体系测定Cu（Ⅱ）有很高的灵敏度和选择性,线性范围为5.0×10^-8-5.0×10^-5 mol/L,检测限为1.0×10^-8 mol/L。

大黄鱼中硫磺素T残留的HPLC分析

建立了反相高效液相色谱法测定染色大黄鱼（Pseudosciaena crocea）中非法添加色素硫磺素T含量的方法.样品经超声水溶液提取,采用Eclipse XDB-C18色谱柱,以甲醇-0.05％（V/V）甲酸为流动相,流速为1.0 mL/min,检测波长为410 nm,外标法测定硫磺素T.结果表明,硫磺素T在0.40～65.0 mg/L范围内线性关系良好（R2=0.9 994）,检出限为0.02 mg/L（S/N=3）,3个浓度水平下的加标回收率为91.0％～98.1％,相对标准偏差（n=6）为1.21％～2.26％.

牛膝醇提物对Aβ_(42)聚集的抑制作用

目的 :观察牛膝醇提物 (Nx E)对Aβ42 聚集的抑制作用。方法 :Aβ42 单独或和Nx E在 37℃ ,5 %CO2 培养箱中孵育后 ,采用硫磺素T(Th T)荧光分析以及透射电镜观察Aβ42 的聚集程度。结果 :1μg·μl 1Aβ42 孵育 7d后荧光强度明显升高 ,电镜观察发现Aβ42 以淀粉样纤维结构为主 ,呈针状聚集 ;低、中、高三个剂量 (7 5、15、30 μg·μl 1)的Nx E与Aβ42 共同孵育 7d后 ,中、高剂量Nx E与Aβ42 的共同孵育产物荧光强度比Aβ42 单独孵育明显减弱 ;形态学观察纤维样结构减少 ,无定形结构增加 ,存在大量散在的颗粒。结论 :1μg·μl 1Aβ42 孵育 7d已“老化” ;15和 30 μg·μl 1的Nx E能在一定程度上抑制Aβ42 聚集。

当归芍药散抑制β-淀粉样肽1-42聚集和纤维形成

目的研究当归芍药散(DSS)抑制β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积的作用。方法老化组单纯用Aβ1～42液,DSS组同时加入DSS,两组均37℃孵育箱体外孵育7d,运用透射电镜和硫磺素T荧光分析方法观察β-淀粉样蛋白Aβ1～42的聚集和纤维化形成的情况。结果电镜观察显示:老化组其纤维呈晶状聚集,长0.34～1.70μm,直径约10nm。DSS组Aβ聚集不明显,无明显Aβ纤维形成,主要表现为无定形结构。硫磺素T荧光分析:DSS组对Aβ纤维形成的抑制率为91.38%。结论提示DSS在体外有抑制Aβ聚集和纤维形成的作用。

天然抗氧化剂TA9901抑制β-淀粉样肽1～40聚集和纤维形成

为寻找治疗老年性痴呆 (AD)的有效药物 ,运用透射电镜和硫磺素 T荧光分析 ,通过体外孵育方式研究天然抗氧化剂 TA990 1对 β-淀粉样蛋白 (Aβ) 1～ 4 0 的聚集及纤维化的影响。电镜观察显示 ,Aβ1～ 4 0 在 PBS(p H7.4)中室温孵育 7d,其纤维呈晶状聚集 ,直径约 8～ 1 0 nm。TA990 1的存在使 Aβ聚集减少 ,无明显 Aβ纤维形成 ,主要表现为无定形结构。Aβ1～ 4 0 与维生素 E(VE)共同孵育 ,Aβ纤维聚集密度明显下降。 TA990 1和 VE联用使 Aβ纤维的形态主要表现为网状分布的 Aβ原纤维 ,直径约 3～ 5nm。荧光分析揭示 ,TA990 1 ,VE和二者联用对 Aβ纤维形成的抑制率分别为 95.0 % ,3 8.6 %和 6 7.6 %。结果表明 ,TA990 1 ,VE和二者联用均可以不同程度地抑制 Aβ聚集及纤维形成 ,以 TA990 1的抑制作用最强。提示 TA990 1有望发展成为以Aβ为靶治疗 AD的候选药物。

成熟中性粒细胞中淀粉样变纤维成分的检测

目的:先前报道红细胞中存在淀粉样纤维,本文进一步探讨成熟中性粒细胞是否存在淀粉样变纤维,为解析阿尔茨海默病(AD)淀粉样变形成分子机制提供科学依据。方法:收集AD患者以及对照人群各30例,利用希森美康X5-500i血液分析仪测定血液白细胞、红细胞、血红蛋白水平以及中性粒细胞绝对值等4项指标,采集静脉EDTA-K_2抗凝血分离中性粒细胞,分别测定中性粒细胞与淀粉样变特异探针之间亲和性,血浆部分用硫磺素T(ThT)检测淀粉样变荧光强度。结果:亲和试验结果显示淀粉样变荧光探针(ThT)能够与组织淀粉样变纤维特异性结合,中性粒细胞中淀粉样变纤维染色也呈现阳性反应。AD组与健康对照组间血细胞白细胞、红细胞、血红蛋白水平以及中性粒细胞绝对值比较差异无统计学意义(P>0.05),但是血浆淀粉样变荧光强度显著高于对照组(P<0.05)。结论:报道成熟中性粒细胞发现淀粉样变纤维,且AD患者血浆淀粉样变纤维水平显著增高。

聚电解质诱导的硫代黄素T激基缔合物及其对温度的荧光比率传感

研究了在水溶液中阴离子聚电解质聚苯乙烯磺酸钠(PSS)对阳离子型染料硫代黄素T(ThT)荧光光谱的影响,并考察了PSS存在下,ThT在水溶液中所形成激基缔合物的影响因素。实验证明,通过静电吸引作用,PSS可以增加ThT的局部浓度,从而显著地促进ThT激基缔合物的形成;ThT单体及其激基缔合物荧光强度(IM及IE)随温度的变化发生有规律的变化,ln(IE/IM)与1/T有较好的线性关系,据此可建立一种新型的对温度敏感的可裸眼识别的荧光比率传感,该传感可有效地消除激发光强度的不稳定性和光强漂移等环境因素的影响,提高了识别的准确度。

硫代黄色素T的合成

研究了以对二甲氨基苯甲酸为原料,通过酰氯化反应,再和5-甲基-2-甲氨基苯硫酚进行缩合反应合成硫代黄色素T。产品的总收率大于75%。

硫代黄素T与溶菌酶淀粉样纤维结合的荧光停流动力学

蛋白淀粉样纤维与多种疾病有关,如阿尔茨海默病、帕金森病、Ⅱ型糖尿病等.荧光染料硫代黄素T(ThT)广泛地应用于淀粉样纤维的定性和定量测定.但从目前的研究来看,ThT与淀粉样纤维结合的动力学机理研究尚非常少见.本研究应用荧光停流动力学技术对盐酸胍诱导的溶菌酶淀粉样纤维和ThT的结合动力学进行了研究,提出ThT与溶菌酶淀粉样纤维结合的动力学符合双位点平行反应机理模型.本研究对深入理解荧光染料分子与蛋白淀粉样纤维的作用有借鉴意义.

S14G-humanin对β-淀粉样蛋白纤维化及其细胞毒性的影响

目的探讨S14G-humanin(HNG)对β-淀粉样蛋白(Aβ)纤维化及其细胞毒性的影响。方法于体外将Aβ1-42和不同浓度HNG共孵育,并设空白对照,应用硫黄素-T(Th-T)荧光法和透射电镜方法,观察HNG对Aβ1-42纤维化的作用;将Aβ1-42和不同浓度HNG共孵育后加入培养的大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤细胞(PC12细胞),应用MTT法测定PC12细胞活性,观察不同浓度HNG对Aβ1-42细胞毒性的拮抗作用。结果 (1)不同浓度HNG(100、200、400μmol/L)+Aβ1-42(100μmol/L)组Th-T荧光强度(241.86±8.41,188.27±4.47,112.36±5.27)均较Aβ1-42组(514.85±14.52)显著降低(P<0.01),且各组Th-T荧光强度随HNG浓度增加而降低,各组间比较有统计学差异(P<0.01)。(2)透射电镜观察表明不同浓度HNG+Aβ1-42组纤维性Aβ均较Aβ1-42组显著减少。(3)不同浓度HNG(10、20、40μmol/L)+Aβ1-42(10μmol/L)组PC12细胞活性〔(67.83±3.57)%、(79.26±3.13)%、(89.67±3.25)%〕均较Aβ1-42组〔(57.52±5.41)%〕显著增加(P<0.01),且各组细胞活性随HNG浓度增加而增加,各组间比较有统计学差异(P<0.01)。结论 HNG在体外能够有效减少纤维性Aβ1-42形成并可抑制其细胞毒性作用,提示HNG有可能成为有效防治阿尔茨海默病的新药物。

一种水溶性超分子荧光探针对农药缩节胺的识别

八元瓜环(Q[8])能使碱性黄T(thioflavin T,ThT)荧光增强,在荧光探针(Q[8]/ThT)中加入缩节胺(mepiquat chloride,MC)后荧光强度又逐渐降低,因此,利用超分子配合物Q[8]/ThT的荧光“开-关”效应,设计了一种超分子荧光探针(Q[8]/ThT),实现了MC的快速检测。研究结果表明,该探针在pH=7的Tris-HCl溶液中对MC具有很好的识别能力,且在一定浓度范围呈线性关系,其检出限为3.6×10^(-8) mol/L。此外,通过核磁共振波谱(1H NMR)和等温滴定量热法(isothermal titration calorimetry,ITC)考察了探针对MC的识别机理,推测出MC的加入与超分子荧光探针(Q[8]/ThT)中Q[8]的端口发生了主客体相互作用,即Q[8]、ThT和MC形成了2∶2∶2的作用模式。

硫黄素T对淀粉样β-蛋白质40聚集成核动力学的双重影响(英文)

荧光染料硫黄素T常用于淀粉样纤维聚集过程的定性定量检测。虽然有研究表明,某些抑制淀粉样蛋白质聚集的小分子抑制剂会与硫黄素T相互作用,影响其测试结果。但硫黄素T如何影响淀粉样蛋白质的聚集成核动力学尚不清晰。本文以淀粉样β-蛋白质40(Aβ40)为模型,系统研究了硫黄素T对Aβ40聚集成核的影响。研究发现:硫黄素T能够显著改变Aβ40的聚集成核动力学,且影响程度与硫黄素T的浓度密切相关。即在低浓度硫黄素T存在下,Aβ40成核速率的延迟时间先随着硫黄素T浓度的升高而缩短,后随着硫黄素T浓度的升高延迟时间反而延长。但延伸的速率却随硫黄素T浓度的升高而缓慢增大。另外,硫黄素T基本不会影响Aβ40的二级结构和纤维形态。同时,等温滴定微量热实验结果表明,硫黄素T结合Aβ40之间的主要作用力为疏水相互作用。据此,本研究提出硫黄素T对Aβ40聚集成核动力学的双重影响机理。这些结果有助于进一步了解硫黄素T与淀粉样蛋白质的作用特点,为今后硫黄素T在Aβ40聚集成核动力学实验中的使用提供参考。

氯碘羟喹对β-淀粉样蛋白聚集影响的体外研究

目的考察氯碘羟喹(clioquinol,CQ)在体外对β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)聚集的影响以及这种作用是否与金属离子Zn2+相关。方法采用硫黄素T(thioflavin,Th-T)结合实验检测聚集态Aβ;采用全波长吸收光谱扫描和竞争结合实验排除Th-T结合实验中可能存在的假阳性因素;采用圆二色谱检测Aβ的β-折叠。结果 CQ直接与单体态Aβ或聚集态Aβ共孵育24 h后均能明显降低Th-T的荧光强度;全波长吸收光谱扫描显示CQ在450 nm和485 nm附近均无特异性吸收峰;竞争结合实验表明,增加Th-T无法使体系的荧光强度恢复到最大;圆二色谱扫描结果表明,CQ可抑制Aβ的β折叠形成。CQ影响Aβ聚集的量效关系研究表明,单体态Aβ与CQ孵育时,其抑制Aβ聚集的IC50值在无Zn2+和含Zn2+体系中分别为6.1和4.3μmol/L;在已聚集的Aβ体系中,其解聚Aβ的IC50值在无Zn2+和含Zn2+体系中分别为7.5和6.1μmol/L。结论 CQ可直接抑制Aβ聚集,并使已聚集的Aβ解聚,且在pH为6.6条件下,实验体系中的Zn2+对CQ抗Aβ聚集的能力没有明显影响。

类叶升麻苷对β-淀粉样蛋白聚集影响的体外研究

目的研究类叶升麻苷(Acteoside,AS)在体外对β-淀粉样蛋白片段(Aβ_(1-42))聚集的影响。方法采用硫黄素T(Th-T)结合实验研究各个浓度AS对单体态Aβ_(1-42)聚集的抑制作用以及对聚集态Aβ_(1-42)的解聚作用、呈现出的量效关系;通过对AS和AS+Th-T进行300~600nm全波长吸收光谱扫描以及(160、320、640μmol/L)AS与(1.25、2.5、5、10、20、40、80、160和320μmol/L)Th-T竞争结合实验,排除实验中可能存在的假阳性因素。结果硫黄素T结合实验表明,加入AS共同孵育24h后,单体态或聚集态Aβ_(1-42)的荧光强度均能减弱;全波长吸收光谱扫描显示在450nm和485nm处,AS、AS+Th-T均无特异性吸收峰,在450nm处给予刺激后,485nm附近也没有出现强的吸收;竞争结合实验表明,固定AS浓度,增加Th-T浓度,不会使荧光强度恢复至未加入AS组,则两者不存在相关结合位点;在AS影响Aβ_(1-42)聚集的量效关系实验中,AS抑制Aβ_(1-42)聚集的IC_(50)为254.3μmol/L,对聚集态Aβ_(1-42)解聚的IC_(50)为282μmol/L。结论 AS可有效抑制单体态Aβ_(1-42)的聚集,对聚集态的Aβ_(1-42)也有明显解聚作用,提示AS对老年痴呆具有潜在的治疗作用。

硫黄素T与侧翼连接双链DNA的G-四链体高特异性作用

富G碱基的DNA序列在离子诱导下可形成G-四链体(G4),基于这一构型转化设计了大量的传感检测平台。其中的荧光检测平台是基于G4与荧光小分子的相互作用。但是,G4与荧光小分子的有效结合依赖于G4构型和体系中存在的离子种类和离子浓度,尤其是高Na^(+)浓度(140 mmol·L^(-1))。那么如何实现G4与荧光小分子普适性地有效结合,并不依赖于体系中的Na^(+)和Na^(+)浓度,是一个难题。在本研究中,以最简单的富G DNA序列凝血酶适体链TBA(thrombin binding aptamer)为例,在3’端和5’端分别增加10个碱基(TBA-10 bp),K^(+)诱导TBA-10 bp形成K^(+)稳定TBA(K^(+)-TBA,G4)并衔接含有10个互补碱基对的双链DNA(K^(+)-TBA-10 bp)。相较于K^(+)-TBA,硫磺素T与K^(+)-TBA-10 bp结合后的荧光强度增加了100倍,相互作用强度增加了1000倍,而且与体系中的Na^(+)(5–140 mmol·L^(-1))无关。结合荧光光谱,紫外吸收光谱和圆二色光谱发现硫磺素T特异性的嵌合于K^(+)-TBA和双链DNA衔接处的空腔内。有趣的是,这一结合模式不受G4构型的影响。该研究结果为研究G4与荧光小分子的有效结合提供了新视角,也为拓展G4在生物功能和生化检测领域的应用提供了实验依据。

蛛丝蛋白MiSp重组模块R1R2CT表达及其纤维化动力学研究

为探索蛛丝蛋白模块单元在成丝过程中的作用,研究了大腹园蛛MiSpR1R2CT功能模块在不同pH条件下的纤维化动力学特性。大腹园蛛MiSp蛋白的R1R2CT功能模块与硫氧还蛋白融合,并在BL21（DE3）中进行表达,表达量约为15mg/LLB培养基。R1R2CT蛋白在pH7.5和6.5时较为稳定,在22h之内不发生纤维化;当pH值降至5.5时,R1R2CT在前2h内快速纤维化,3～5h趋势较为平缓;5h之后R1R2CT蛋白再次出现ThT信号的快速增长,7h后保持缓慢增长至22h。R1R2CT的增长速率及幅度高于单独的CT（C-termi-nal）蛋白,而单独的R1R2在pH7.5、6.5和5.5时均保持稳定,表明重复区依赖CT模块的快速纤维化模式。已有研究表明,CT在重复区纤维化过程中起晶核作用,该成果也从反面证实CT的晶核理论。

姜黄素体外抑制Aβ_(42)聚集和毒性作用及结合老年斑的研究

目的为了研究姜黄素对β-淀粉样多肽42(Aβ42)聚集和神经毒性的影响,以及姜黄素对阿尔茨海默病(AD)患者脑组织中老年斑的结合情况。方法通过硫磺素T(Th-T)荧光分析Aβ42蛋白体外聚集特点和姜黄素对Aβ42聚集的抑制作用;应用培养的SK-N-SH细胞、MTT法观察不同孵育时间的Aβ42神经毒性以及姜黄素对神经毒性的影响;利用姜黄素自发荧光特性观察其对AD病人海马组织石蜡切片中老年斑的结合作用。结果 Th-T荧光分析结果显示随着孵育时间的延长,Aβ42的荧光强度逐渐加强,在6 d时荧光强度明显增加(P<0.01),加入姜黄素(20μmol/L)能够显著降低Aβ42的荧光值;孵育时间超过0.5 d的Aβ42对SK-N-SH细胞均可产生毒性作用,细胞存活率、细胞突起和长度均减小。而经姜黄素(20μmol/L)治疗后,SK-N SH细胞存活率明显升高,细胞突起增多、变长;姜黄素还能够特异性标记AD病人海马组织中Aβ40/42抗体免疫阳性和免疫阴性老年斑。结论姜黄素能够有效抑制Aβ42体外聚集,并减小其神经毒性。在AD病人海马组织切片上,姜黄素能够特异性结合AD病人脑中沉积的老年斑,具有比抗体更广泛的老年斑结合能力。上述结果提示姜黄素有可能成为阻止AD发生和阻断疾病进展的治疗性药物。