Separation and Purification of Thrombin-like Enzymes by Affinity Adsorbents

An affinity adsorbent, benzamidine Sepharose 4B, was used to separate and purify thrombin like enzymes. The p aminobenzamidine as a specific ligand was coupled to the matrix-Sepharose 4B. The recombinant thrombin like enzyme-defibrase was used as a model in order to evaluate the efficiency of this biospecific affinity adsorbent. The homogeneity of the enzyme preparation was comfirmed as one band on sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis.

血清凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物、可溶性fms样酪氨酸激酶-1水平与脓毒症患者病情进展和预后的关系

目的探讨血清凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物(TAT)、可溶性fms样酪氨酸激酶-1(sFlt-1)水平与脓毒症患者病情进展和预后的关系。方法选取2021年1月至2023年5月该院收治的脓毒症患者117例作为观察组,另选取同期在该院的体检健康志愿者42例作为对照组。脓毒症患者根据病情程度分为普通脓毒症组(60例)、脓毒性休克组(57例)。观察组根据治疗90 d后的预后情况分为死亡组和存活组。采用酶联免疫吸附试验法检测血清TAT、sFlt-1水平。通过Logistic回归分析脓毒症患者死亡的影响因素并建立基于TAT、sFlt-1的脓毒症患者预后预测模型,受试者工作特征(ROC)曲线分析指标对脓毒症患者死亡的预测价值。结果观察组血清TAT[(12.59±5.35)ng/mL]、sFlt-1[(28.58±4.05)ng/mL]水平高于对照组[分别为(2.65±0.88)ng/mL、(16.50±3.60)ng/mL],差异有统计学意义(t=19.386、17.065,P<0.001)。脓毒性休克组血清TAT[(15.09±4.99)ng/mL]、sFlt-1[(30.45±3.30)ng/mL]水平高于普通脓毒症组[分别为(10.22±4.57)ng/mL、(26.81±3.92)ng/mL],差异有统计学意义(t=5.503、5.429,P<0.001)。死亡组脓毒性休克占比、序贯器官衰竭评估(SOFA)评分、急性生理学与慢性健康状况评分系统Ⅱ(APACHEⅡ)评分、血乳酸、降钙素原、TAT、sFlt-1水平高于存活组,差异有统计学意义(P<0.05)。脓毒性休克、SOFA评分增加、APACHEⅡ评分增加和血乳酸、TAT、sFlt-1升高为脓毒症患者死亡的独立危险因素(P<0.05)。ROC曲线分析显示,预测模型预测脓毒症患者死亡的曲线下面积(AUC)为0.947,大于病情程度、SOFA评分、APACHEⅡ评分、血乳酸、TAT、sFlt-1单独预测的AUC(Z=6.525、4.414、4.835、3.787、3.956、3.507,P<0.001)。结论脓毒症患者血清TAT、sFlt-1水平升高与病情进展和预后不良密切相关,且基于TAT、sFlt-1建立的预测模型对脓毒症患者死亡有较高的预测价值。

一种蛇毒类凝血酶纯化新方法

目的提供一种蛇毒类凝血酶的新纯化方法。方法蛇毒经预处理后,依次经过苯甲脒琼脂糖凝胶亲和色谱、阳离子交换色谱和疏水色谱后获得蛇毒类凝血酶,分别对活性、分子量及纯度进行检测,并与使用现有专利方法制备的蛇毒类凝血酶进行质量比较。结果新方法制备的蛇毒类凝血酶与现有专利方法相比,分子量无明显差异,但新方法的比活力更高,且纯度更高,同时新方法的工艺稳定性更佳。结论新方法与现有专利方法相比,简化了工艺步骤,缩短了纯化周期,减少了过程环境暴露风险,可获得高纯度类凝血酶,工艺稳定性高,产品质量一致性好,利于临床安全用药。

大连蛇岛蝮蛇类凝血酶基因在毕赤酵母中的克隆表达及分离纯化(英文)

根据同源性分析设计引物 ,通过RT PCR方法从大连蛇岛蝮蛇毒腺总RNA中合成扩增出类凝血酶基因 ,之后将该基因克隆到表达载体 pPIC9K中 ,经电激转化后整合至毕赤酵母细胞基因组中 .经筛选得到甲醇快速生长型转化子His+ Mut+ 在 5 0 0ml摇瓶中培养 ,甲醇诱导分泌表达 .上清液中重组类凝血酶是通过两步柱层析得到 :QSepharoseFF和Benzamidine Sepharose 4BCL .与天然蛇毒类凝血酶一致 ,分泌表达的重组类凝血酶具有较强的酯酶活性 ,但精氨酸甲酯如TAME的水解活性较弱 .此重组类凝血酶在 37℃中性溶液中保存过夜将分解成小肽 ,但在 0℃下很稳定 .该酶的最适pH为 8 0 .

大连蛇岛蝮蛇类凝血酶基因克隆与表达研究

根据同源性设计引物,通过RT-PCR方法从大连蛇岛蝮蛇毒腺总RNA中合成扩增出类凝血酶基因,并由此推测出其相应的氨基酸序列.将该基因克隆到表达载体pPIC9K中,经电激转化后整合至毕氏酵母细胞中获得表达.该表达产物经两步柱层析后,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,获得单一条带,并表现较强的生色底物活性.

重组巴曲酶在毕赤酵母中的高效表达

以毕赤酵母为表达系统,建立生产重组巴曲酶的技术工艺路线。通过递归式PCR的方法,人工合成了巴曲酶基因,将其插入pPIC9表达质粒中,转化至毕赤酵母GS115(his4),筛选出的表达株经甲醇诱导,表达了重组巴曲酶,并得以纯化。从每升发酵液中可纯化得到10mg重组巴曲酶,其比活为238NIHunits/mg,分子量为30.55kD。重组巴曲酶在体外可使纤维蛋白凝固,在体内缩短小鼠出血时间。为开发重组的蛇毒类凝血酶止血剂打下了基础。

大连蛇岛蝮蛇类凝血酶在大肠杆菌中的表达与纯化

将编码大连蛇岛蝮蛇类凝血酶 (Gloshedobin)的基因克隆于表达载体pET 32a( + )中 ,以融合蛋白形式在大肠杆菌中获得表达。在 2 5℃下经 1mmol LIPTG诱导 6h ,SDS PAGE和蛋白质印迹分析表明 ,部分融合蛋白以可溶形式存在于大肠杆菌的细胞质中。针对金属螯合亲和层析分离某些含His 标签重组蛋白质时专一性不高 ,并且存在配基泄漏的缺陷 ,设计合成了以抗重组类凝血酶的鸡卵黄免疫球蛋白为配基的免疫亲和层析柱。通过疏水色谱OctylSepharoseFF ,IgY免疫亲和层析以及强阴离子交换色谱SourceQ等三步柱色谱分离纯化获得比活力为 45 4 7U mg的重组蛇毒类凝血酶 ,活力回收率为 34 8%。蛋白质印迹分析和纤维蛋白原凝结活性分析表明 。

蛇毒类凝血酶研究进展

对有关蛇毒类凝血酶(SVTLEs)的分布分类、理化性质、酶学性质、结构特征、基因克隆表达、临床应用等方面的研究资料进行了概括和综述。结果发现:SVTLEs主要分布在蝮亚科和蝰科毒蛇的毒液中;根据SVTLEs水解纤维蛋白原释放FPA和FPB的速度不同,可将其分为SVTLE-AB、SVTLE-A和SVTLE-B等3类;多数SVTLEs的分子量在30～50kD,含6个二硫键,pI较低,部分SVTLEs的pI较高;SVTLEs可水解TAME和BAEE,其活性可被DFP和PMSF所抑制,但不被胰蛋白酶trypsin及凝血活性中心His的专一抑制剂TLCK和EDTA抑制;对SVTLEs的一级结构和二级结构研究较多,对高级结构研究有待深入;很多SVTLEs基因在大肠杆菌中成功获得了表达,但表达物不能被糖基化和正确折叠,故没有活性或活性不高,而其在真核表达系统中表达活性较高;部分碳水化合物具有稳定SVTLEs结构及提高SVTLEs的酶活力的作用;SVTLEs的临床应用涉及心肌梗塞、缺血性中风、血栓性疾病等疾病的治疗。SV-TLEs未来的研究重点将集中于其在真核表达系统的表达和对其高级结构的解析。

新的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶Agacutin止血作用的实验研究

目的:研究类凝血酶Agacutin的止血效果.方法:新西兰白兔静脉注射Agacutin,观察血凝和纤溶指标;小鼠皮下注射Agacutin,采用小鼠剪尾试验测定其止血效果.结果:静脉注射Agacutin 0.01～0.05U·kg-1后,各组全血凝固时间与给药前相比均有不同程度的缩短(44.9%～60.5%),给药后30 min药效达高峰,药效持续24h.与给药前比较,各组兔血纤维蛋白原含量和血粘度在给药后有不同程度的降低,这与血液凝固时间缩短一致.试验结果显示,Agacutin对部分凝血活酶时间、血小板数量、血小板释放活性、血小板体外聚集、优球蛋白凝固时间均无明显影响,但对优球蛋白溶解时间有不同的缩短,显示有弱的溶栓活性.腹腔注射Agacutin0.5～2 U·kg-1剂量后,小鼠剪尾出血时间有不同程度的缩短(24%～66%).结论:Agacutin在血管内引起较高浓度的可溶性纤维蛋白且不激活凝血因子Ⅱ和XIII,在伤口部位加速止血,在正常的血管内,不会造成血栓形成.

五步蛇蛇毒类凝血酶N端的部分氨基酸序列

从五步蛇蛇毒中纯化得到的类凝血酶 ,在SDS PAGE及IEF均为一条带 ,且分子质量约 38ku ,等电点约为 4 0。测定该酶N端 1 5个氨基酸的序列是VIGGVECDINEHRFL 。

在大肠杆菌中表达蝮蛇毒类凝血酶基因gloshedobin

将大连蛇岛蝮蛇毒腺中的类凝血酶基因gloshedobin克隆到pET-32a(+)上,构建了T7启动子控制的大肠杆菌表达质粒,并考察了质粒的稳定性. 采用IPTG诱导,以融合蛋白的形式进行表达,得到以包涵体形式存在的类凝血酶. 通过实验对诱导时间、诱导温度及诱导剂浓度进行了优化,并采用正交实验考察了金属离子对表达的影响,结果表明Fe3+, Co2+对类凝血酶的表达有促进作用.

五步蛇蛇毒的分离纯化及综合利用

五步蛇蛇毒冻干粉经过SephadexG-75分子筛层析,使纤溶酶和类凝血酶初步分离;DEAE阴离子交换层析对2种酶进一步分离纯化,分别得到了纤溶酶和类凝血酶。2种酶在HPLC图谱上均呈单一峰,在SDS-PAGE图谱上均为单一条带,纤溶酶分子量大约为24.1kDa,类凝血酶分子量大约为14.4kDa,与以往报道相符。酶的总活力回收率大大提高,纤溶酶的活力回收率达23.9%,类凝血酶的活力回收率达34.5%。实现了对蛇毒的综合利用,为进一步开发利用蛇毒探索了一条有效的途径。

蕲蛇蛇毒中一个新的类凝血酶的分离纯化与表征

使用DEAE SephadexA 5 0、POROS 5 0HS及POROS 2 0PI等色谱分离技术 ,从蕲蛇粗毒中分离提纯得到 1个具有凝血活力的组分 ,经SDS PAGE和PAGE检测均为一条带 ,非还原条件下相对分子质量 2 4 .3kDa,还原条件下相对分子质量 33.0kDa ;其凝血活力为 91 .0NIHu mg.该组分不具有激活因子ⅩⅢ的活性 ,肝素不影响该组分的凝血活性 ,EDTA部分抑制其活性 ,苯甲基磺酰氟 (PMSF)则会产生不可逆抑制作用 .该酶N 末端氨基酸序列为VIGGNGXDINEHRFLVAFF 。

尖吻蝮蛇毒凝血酶样酶在兔体内的药物动力学

本文采用双抗体夹心酶联免疫吸附检测(ELISA)技术,研究家兔一次快速iv 75,150及300μg/kg的凝血酶样酶(thrombin—like enzymes,TLEs)后24 h内血浆药物代谢动力学。结果表明,TLEs在家兔的血浆浓度时间过程以三室模型模拟较为合适,三种剂量的各参数的均数之间经F检验除中央室表观分布容积外无显著差别。其t_(1/2α)为3.86～5.12min,t_(1/2β)为43.3～59.8min,t_(1/2γ)为17.6～19.5h。

尖吻蝮蛇毒中一种新类凝血酶的分离纯化

用阴离子交换色谱和凝胶过滤色谱技术,从尖吻蝮蛇毒中纯化得到一个具有凝血活性的组分。经Superdex75HR10/30预装柱检测,纯度达99.91%。SDS-PAGE显示为单一条带,还原、非还原条件下分子量分别为59.25k、52.58k。该组分的凝血酶比活为41.5u/mg,精氨酸酯酶比活为14.29u/mg,但不激活血浆凝血因子ⅩⅢ。EDTA不能抑制其凝血活性,而苯甲磺酰氟则产生不可逆抑制作用。结果表明该酶是一种新尖吻蝮蛇毒类凝血酶。

长白白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶制品的生化分析

对长白白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶的理化及酶学性质进行系统研究． 结果表明， 该酶为一分子量为３８ ０００， 等电点为４５０ 并对温度有很高稳定性的糖蛋白， 该酶的最适ｐ Ｈ 值为８０，其活力可被 Ｄ Ｆ Ｐ 和 Ｐ Ｍ Ｓ Ｆ抑制．

降纤酶研究进展

降纤酶(Defibrase)是从尖吻蝮蛇Agkistrodon acutus和长白山白眉蝮蛇Agkistrodon halys ussuriensis蛇毒中提取分离得到的一种类凝血酶。具有显著的去纤、降粘、溶栓等作用,广泛地应用于临床治疗和预防心脑血管血栓性疾病。对降纤酶的生化性质与结构、生产制备、药理作用与临床应用以及质量分析与控制等方面的研究进行了综述。

尖吻蝮(Agkistrodon acutus)蛇毒凝血酶样成分的研究——Ⅲ.蛇毒凝血酶止血效应的研究

将纯化得到的蛇毒凝血酶(TLE_3、TLE_4),经家兔体内实验表明,2—3凝血酶单位/kg体重剂量能显著地使家兔全血凝血时间缩短1/3—1/2。药后1小时即有促凝作用,以2—4小时凝血(止血)效应最强,12小时已消失。与Holleman, W. H.等自美洲矛头蝮蛇毒中得到的蛇毒凝血酶(Hemocoagulase)相似。经家兔及家犬实验性创伤止血实验表明,对创伤出血有止血作用。

尖吻蝮蛇类凝血酶基因的克隆及生物信息学分析

为了获得蛇毒类凝血酶基因,本研究根据不同蛇毒类凝血酶cDNA5'和3'保守性序列设计了引物;通过RT-PCR从尖吻蝮蛇毒腺总RNA中扩增到1个808bp特异性片段,将该cDNA重组到pMD18-T载体中,利用生物信息学的方法对测序结果进行了分析。结果表明:该特异性片段中有一个783bp的开放阅读框架,其编码蛋白质序列与蛇的类凝血酶序列有98.5%的同源性,也具有蛇毒类凝血酶的典型特征。结论:本实验获得了一个新的尖吻蝮蛇类凝血酶基因。

^(131)I标记尖吻蝮蛇毒凝血酶样酶在动物体内的分布

用氯胺T法对尖吻蝮(Agkistrodon acutus)蛇毒的抗血栓组分凝血酶样酶进行^(131)Ⅰ标记,观察其在大、小鼠体内的分布。以实验组和给予同剂量凝血酶样酶混合Na^(131)Ⅰ的对照组的放射性参入量(脏器与血液放射比)的比值作为凝血酶样酶在组织中分布的依据。结果表明,一次快速ⅳ凝血酶样酶后2h分布最多的为肾、其次为肺、脾、肾上腺和肝。给药后4h,肾、脾、肺和肝比2h时高,心脏含量较少,其它组织未见有分布。尿中含量高,表明其主要经肾脏随尿排泄;经胆汁排出则很少。