Bt杀虫晶体蛋白—肠溶性微囊制备方法的初步研究

【目的】研究Bt(Bacillus thuringensis)晶体蛋白肠溶性微囊的制备方法,为进一步研究它对防止紫外线损伤晶体蛋白及促进晶体蛋白在害虫中肠快速释放等方面的作用奠定基础;【方法】用复相乳液法制备肠溶性微囊,并应用L16(45)正交试验设计研究相关因子对微胶囊包封率的影响;【结论】采用复相乳液法可以制备Bt晶体蛋白的肠溶性微囊。5个因子对包封率有显著影响,影响大小依次为乳化转速>HPMCP浓度(壁材)>Bt晶体蛋白含量(芯材)>蓖麻油含量(助剂)>甲基纤维素浓度(亲水胶体)。以500ml分散系为条件,筛选出的肠溶性微胶囊较佳工艺为:8.6mg/mLBt晶体蛋白溶液1ml,20mg/mL HPMCP溶液50ml及蓖麻油2ml,三者混合并在匀化器转速6000r/min下乳化,而后分散于2.1%或3.3%甲基纤维素钠溶液中成囊。

花粉管通道法将Bt毒蛋白基因导入优良玉米自交系

以杂交育种中广泛使用的优良玉米自交系为材料 ,用花粉管通道法介导质粒pGBIL0 4(actin Bt 35S bar)DNA的转化 ,经对T0 代 1 4 0 3株植株Basta抗性筛选和PCR分子鉴定 ,共获得 5株PCR阳性植株 ,分别为授粉后 8,1 2 ,1 4 ,1 8h导入所得 ,总的平均转化率为 0 36 %。结果表明 :只要掌握好导入时机 。

昆虫对Bt抗性的适合度代价及其与抗性治理策略的关系

由于昆虫对Bt毒素抗性的发展,不利于Bt制剂和Bt转基因作物的长期有效使用。但是昆虫对Bt抗性的产生常伴有适合度代价,这种代价能够延缓或阻碍抗性等位基因的发展。许多研究已经证明,有分属鳞翅目、鞘翅目以及双翅目的昆虫Bt抗性品系存在适合度代价。适合度代价往往会受生态因素的影响。而且,昆虫适合度代价的产生与其抗性机制密切相关。庇护所策略延缓抗性发展的能力不仅与敏感种群与抗性种群能否自由交配有关,还与适合度代价的大小及抗性基因的显隐性等因素有关。适合度代价的研究对探讨抗性发展规律以及完善抗性治理策略是非常重要的。本文从适合度代价与抗性发展、抗性机制和抗性治理的关系等方面的进行综述,为发展Bt抗性治理策略提供参考依据。

灭蚊幼芽孢杆菌剂型的研究与应用

目的 针对蚊虫的生态习性和不同孳生地特点，研制具有即效又有持效的灭蚊幼芽孢杆菌剂型。方法 选用漂浮剂锯末粉为载体，加粘附剂和分散剂，按一定比例制成不同剂型进行灭蚊幼试验，并观察不同剂型对哺乳动物、非靶生物的影响。结果 Bti-187颗粒剂，稻田灭中华按蚊幼虫持效为12～16d，块剂在小型孳生地灭致倦库蚊和白纹伊蚊幼虫，持效分别可达17和12d，BS-C3-41颗粒剂、块剂灭致倦库蚊幼虫持效分别可达19和94d。Bti-187和BS-C3-41发泡剂有较好的即效，48h灭蚊幼效果达100％，持效分别可达15和21d。结论 针对不同蚊虫孳生地特点，采用不同剂型配合使用，蚊虫密度平均下降70％～100％。能有效控制成蚊密度，削平成蚊季节高峰。

紫外线使苏云金芽孢杆菌伴孢晶体失活机理的研究

用电镜、电泳、生物鉴定等方法,研究了紫外线对苏云金芽孢杆菌库斯塔克变种的伴孢晶体的影响。结果表明,紫外线能破坏伴孢晶体的表面结构和形态,降低伴孢晶体在碱性液和蚕胃液中的溶解度,5小时以上的长时间照射,能导致伴孢晶体完全不溶,因而不能降解为具有杀虫活性的毒素蛋白而失活。

农杆菌介导Cry1Ac基因转化菊花

用农杆菌介导法,以茎段(节间)为外植体,将含有苏云金芽孢杆菌(Bt)毒蛋白Cry1Ac基 因的植物遗传载体导入菊花(切花菊)品种‘日本黄’中,得到126株抗性植株,PCR检测及基因组DNA 的Southern杂交分析表明Cry1Ac基因已整合到菊花总DNA中,共获得6株转基因植株。利用棉铃虫做转基 因植株的盆栽和叶片平皿试验,发现其中2株对棉铃虫具有很高抗性,校正死亡率达90%以上;1株对棉 铃虫具有高抗性,校正死亡率达80%以上;3株对棉铃虫抗性较明显,校正死亡率44.7%～60.9%。

海南岛热带雨林区芽孢杆菌收集及Bt菌鉴定

本研究系统地对海南岛热带雨林自然保护区进行了土壤样品的采集、芽孢杆菌的分离收集和Bt菌株的鉴定。从尖峰岭热带雨林区、五指山热带雨林区、吊罗山热带雨林区、霸王岭热带雨林区总共采集了土壤样品1882份,采用醋酸钠培养基结合高温方法分离出芽孢杆菌3924份,鉴定出Bt分离株158份,Bt菌株的分离率和出菌率分别为4.03%和8.40%。结果分析表明,海南岛热带雨林区芽孢杆菌及Bt菌株分布对环境和生态表现出一定的规律性,一般海拔900m至1400m的Bt菌株含量高、植被覆盖率高,土壤腐殖质含量高的热带沟谷雨林带Bt菌株含量最高。显微观察发现,获得的Bt菌株其伴胞晶体有菱形、球形、方形、椭球形、不定性等多种形状。利用SDS-PAGE方法对获得的Bt分离株进行了伴胞晶体进行分析,发现伴胞晶体的分子量有20kD到150kD不等。进一步利用PCR-RFLP技术对Bt分离株进行了cry基因型的分析,初步发现这些Bt菌株含有cry1、cry3、cry4、cry6、cry30、cry40等基因型。我们还利用鳞翅目昆虫小菜蛾和鞘翅目昆虫椰心叶甲进行部分Bt分离株的生物测定,初步结果显示本研究鉴定出的Bt分离株具有不同的抗虫靶标,对同一靶标昆虫也表现出不同的杀虫活性。整体而言,本研究结果显示出海南岛热带热带雨林自然保护区因其独特的热带地理生境、自然的生物演化系统,使得热带雨林区蕴藏了Bt菌株资源多样化,值得期待挖掘出一些新的菌株和新的基因资源。

无活菌苏云金杆菌制剂对稻纵卷叶螟和小菜蛾的田间药效评价试验

本文报道不含有活菌的苏云金杆菌可湿性粉剂在田间应用的药效试验。结果表明:经过辐射处理杀灭活孢子后的苏云金杆菌对稻纵卷叶螟和小菜蛾有良好的防治效果,与未经过处理的Bt可湿性粉剂的效果相比不存在明显的差异。由于该种制剂不含有活菌,对生态环境无不良影响,在田间应用将更加安全。

Bt L-93菌株培养基的正交试验及培养代谢

采用正交试验方法对ＢｔＬ－９３菌株发酵培养基进行筛选，确定了最佳配方ＳＦ－１号，其发酵液菌数可稳定达到７０亿／ｍＬ。通过对２～３龄落叶松毛虫进行生物测定，杀虫效果可达８０％以上。同时考查了此菌株在发酵培养基上的生长、ｐＨ变化、溶氧以及还原糖和氨基氮等诸因子和代谢情况。

苏云金芽胞杆菌Bt20菌株发酵条件的优化

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)Bt20菌株为东北农业大学农业昆虫与害虫防治实验室分离出来的具有独立知识产权的菌株,其对鳞翅目幼虫具有较强杀虫活性,具有良好推广应用价值。文章进行优化Bt20菌株的液态发酵培养基碳源、氮源材料研究,试验以Bt20菌株发酵液吸光度值及对2龄小菜蛾的毒力效果为指标,首先采用单因素试验对Bt20菌株发酵培养基的碳源及氮源进行优化,筛选得到最佳碳源为玉米粉,最佳氮源为蝇蛆、酵母粉、鱼粉、大豆粉;运用正交试验设计方法对优化后的碳、氮源进行正交试验,明确Bt20菌株最佳液态发酵培养基配方为:玉米粉3.0%、蝇蛆3.0%、大豆粉3.0%、酵母粉2.0%;最佳发酵培养基下,Bt20发酵液吸光度值为1.4733,发酵液处理2龄小菜蛾,3 d后校正死亡率为98.31%,显著优于鱼粉发酵液的吸光度值1.0683及校正死亡率88.14%,提高发酵产物产量和毒力,降低生产成本,可为Bt20商品化及大规模应用提供基础依据。

苏云金杆菌悬浮剂杀灭白纹伊蚊不同龄期幼虫实验及其影响因素分析

目的 :研究苏云金杆菌悬浮剂对不同龄期白纹伊蚊幼虫杀灭效果及其影响因素分析 ;方法 :实验室 ,现场实验 ;结果 :苏云金杆菌悬浮剂对白纹伊蚊Ⅰ～Ⅳ龄初幼虫能得到 10 0 %的杀灭效果 ,对蛹和即将化蛹的Ⅳ龄末幼虫完全无杀灭效果 ,积水中的沉积物可影响苏云金杆菌悬浮剂对白纹伊蚊幼虫的杀灭效果 ,沉积物越多 ( 1/ 2～ 2 / 3 ) ,幼虫的杀灭率就越低 ,最高为 66% ,苏云金杆菌悬浮剂对南方地区白纹伊蚊阳性小容器积水幼虫有良好的控制效果 ,持效可达 10d ;结论 :苏云金杆菌悬浮剂对白纹伊蚊幼虫有良好的杀灭效果 ,沉积物较多的积水则用高剂量药 ,为提高持效 ,用药后

抗生素类作为防腐剂对苏云金杆菌芽孢及伴胞晶体的影响

报道了 1 4种抗生素作为防腐剂对苏云金杆菌CH菌株芽孢萌发的抑制作用和对伴胞晶体的影响。结果表明 ,红霉素、盐酸环丙沙星对CH菌株芽孢萌发有较强的抑制作用 ,在 0 5μg/mL低剂量下可抑制芽孢的萌发 ;氧氟沙星和麦迪霉素抑制作用稍差 ,在 5μg/mL的剂量下抑制作用随时间延长而减弱 ,96h后基本丧失抑制作用。其它几种抗生素对苏云金杆菌芽孢萌发的抑制终浓度均在 30 μg/mL以上 ;SDS -PAGE分析和生物测定表明 ,红霉素、盐酸环丙沙、氧氟沙星和麦迪霉素对伴胞晶体均无明显损伤作用 ,其中氧氟沙星 45oC条件下放置 4d,发酵液毒力保持率为 96 2 %。

济宁地区淡色库蚊幼虫对苏云金杆菌的抗性水平研究

通过苏云金杆菌对采集的几株野外淡色库蚊种群幼虫的灭杀作用，分析不同环境下，该蚊对苏云金杆菌抗药性的差异。采用幼虫液浸法，测定不同淡色库蚊种群幼虫对苏云金杆菌的LC50。结果显示，苏云金杆菌BTH-14对采集的几株淡色库蚊种群幼虫有不同的灭杀效果，其中采集于苇坑种群的试虫对苏云金杆菌表现出一定程度的抗性，但到F2代，该种群抗性消失，表明这种抗性不能通过遗传形成持续抗性。结果表明不同的孳生环境会影响淡色库蚊幼虫对苏云金杆菌的抗药性，但其抗性不能遗传给后代。

苏云金杆菌对不同龄期淡色库蚊幼虫的灭杀作用

目的研究苏云金杆菌BYH-14对不同龄期淡色库蚊幼虫的灭杀效果。方法幼虫液浸法,用不同浓度苏云金杆菌溶液对不同龄期淡色库蚊幼虫进行灭杀实验测定。结果苏云金杆菌BTH-14对I～IV龄淡色库蚊幼虫均能达到100%的灭杀效果,但不同龄期所需施药浓度有所差异,龄期越小,所需施药浓度越低。此外,施药7 h后即可以观察到对蚊幼的灭杀效果,施药浓度越接近完全致死浓度,短时间观察到的灭杀效果越显著。结论利用BTH-14进行淡色库蚊蚊幼灭杀,龄期越小,灭杀效果越好。

苏云金芽胞杆菌杀虫原粉对铬离子吸附热力学研究

通过静态吸附试验,研究了苏云金芽胞杆菌原粉对水溶液中铬离子(Cr6+)的吸附热力学特性。铬离子初浓度依次为50、100、150、200、250、300、400、500mg·L^(-1),菌体浓度固定为1g·L^(-1),pH值为2,分别在5℃、20℃、35℃、50℃条件下进行等温吸附,采用Freundlich方程和Langmuir方程进行拟合。结果显示,苏云金芽胞杆菌原粉对铬离子的吸附符合Langmuir(r>0.979)方程和Freundlich(r>0.977)方程。吸附焓△H为1.39￣2.33kJ·mol^(-1),吸附自由能ΔG为-3.75￣-2.84kJ·mol-1,吸附熵ΔS为15.2￣18.8J·mol^(-1)。苏云金芽胞杆菌原粉对铬离子的吸附是吸热过程,吸附能够自发进行。

苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因cry1A的克隆及特征分析

苏云金芽孢杆菌猝倒亚种(Bacillusthuringiensissubsp.sotto)对鳞翅目幼虫有高毒力。根据cry1A类基因序列设计特异引物,应用PCR技术从该菌株中扩增得到一大小约为3 6kb的DNA片段。将获得的片段克隆至pGEM7zf中并转化大肠杆菌DH5α。在ABIPRISM377自动测序仪上对其5′及3′端进行部分测序,结果表明其核苷酸序列与cry1A基因高度同源。

苏云金芽孢杆菌Bt-3701与巨大芽孢杆菌Bm-107种间原生质体融合

具有杀虫活性的苏云金芽孢杆菌(B. thuringensis subsp kurstaki)Bt-3701与具有解磷活性的巨大芽孢杆菌(B. megaterium var. phosphaticum)Bm-107原生质体进行了融合。Bt-3701原生质体形成率为99.4％,再生率为21.4％;Bm-107原生质体形成率为97.5％,再生率为23.8％。以PEG为助融剂进行原生质体融合,得到22个融合子,融合率达6.03×10^(-3)。融合子在双抗培养基(DR-CNB)上连续传代12次,得到4个稳定的融合于生物测定表明,融合子既具有一定的杀虫活性又具有一定的解磷活性。

氯氰菊酯和B.t.iH-14混配对致乏库蚊幼虫的实验室毒效及持效研究

目的 :提高杀虫剂对致乏库蚊幼虫的药效。方法 :将氯氰菊酯与B .t.iH 14混配 ,观察对试虫的半数致死量 (LC50 )及共毒系数。结果 :混配制剂对敏感品系致乏库蚊幼虫的LC50 为0 .0 0 56mg/L ,共毒系数为90 .8;对抗性致乏库蚊幼虫的LC50 为 0 .0 545mg/L ,共毒系数为2 84 .0 3。按 2 .5mg/L浓度对敏感品系及抗性品系试虫的灭效 >80 % ,在实验室的持效时间为 2 1d ,2 1d后灭效迅速下降 ,30d药效基本丧失。结论 :该混配制剂对敏感品系试虫的毒力表现为两者相加作用 ,对抗性品系试虫有明显增效作用 ,持效期长于单独使用 0 .5mg/L氯氰菊酯及2 .0mg/LB .t .iH 14。

苏云金芽孢杆菌溶源菌株的鉴定

本文用不同方法测定了10株苏云茅孢杆菌的溶源性,经鉴定表明,其中9株菌为溶源菌株。这9株菌的噬菌体都可在B.thuringensis var.entomooidus(B_6)上形成浊斑。从p_3感B_6染后的浊斑上分离到了一株溶源茵B_6(p_3)。

氯氰菊酯和B.t.iH-14混配杀虫剂对致乏库蚊幼虫的实验室毒效及持效作用研究

目的 :研究混配杀虫剂对致乏库蚊幼虫的实验室毒效及持效作用。方法 :将 3种药物稀释成不同浓度 ,测定致乏库蚊幼虫的LC50 。结果 :混剂对敏感品系致乏库蚊幼虫LC50 为 0 .0 0 5 6mg/L ,共毒系数为 90 .8,毒力表现为两者相加作用 ;对抗性致乏库蚊幼虫LC50 为 0 .0 5 45mg/L ,共毒系数为2 84.0 3 ,有明显增效作用。 2 .5mg/L浓度对敏感品系和抗性品系的灭效 >80 % ,在实验室的持效时间为 2 1d ,持效长于单独使用 0 .5mg/L氯氰菊酯和2 .0mg/LB .t .iH - 14;混剂在 2 1d后灭效迅速下降 ,30d基本失效。结论 :该混剂既可快速有效地杀灭抗性幼虫 ,同时可延长杀灭残效 ,对提高防制效果。