七彩神仙鱼β-胸腺素基因克隆及表达分析

为了探究胸腺素基因在七彩神仙鱼(Symphysodon aquifasciatus)中的特征、进化和功能,基于转录组序列比对及生物信息学的方法对七彩神仙鱼的胸腺素进行了鉴定、基因与蛋白结构分析、系统发生分析,通过RACE技术克隆获得了七彩神仙鱼胸腺素基因全长,利用qRT-PCR技术研究其在各组织中的表达规律,通过病原感染实验,研究了七彩神仙鱼β-胸腺素基因在病原胁迫下的表达规律。结果显示,七彩神仙鱼的胸腺素基因鉴定为胸腺素β1型,命名为dfTβ。克隆结果显示,dfTβ的全长为779 bp,ORF区序列长度为303 bp,编码100个氨基酸,其5′-UTR为43 bp,3′-UTR为433 bp,含有22个poly-A。系统发育进化分析结果显示,七彩神仙鱼β-胸腺素同尼加拉瓜湖始丽鱼β-胸腺素聚为一簇。qPCR结果显示,β-胸腺素在七彩神仙鱼各组织中均有表达,其中在肠、皮肤、鳃中表达最高,在头肾和脾中表达最低。嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染后,七彩神仙鱼皮肤、头肾、脾和肠中dfTβ均在短时间内显著上调,并随着时间出现先上升后下降的趋势,但各组织中上调倍数最高峰的时间不同。研究结果表明,dfTβ基因参与了七彩神仙鱼受病原刺激后的免疫应答,且表达模式不同,表明其可能在不同组织、免疫的不同阶段发挥不同的作用。

低温胁迫对凡纳滨对虾胸腺肽基因功能的影响

低温是影响凡纳滨对虾养殖的重要因素。为探明凡纳滨对虾在应对低温胁迫下的分子机制,通过RACE方法对凡纳滨对虾胸腺肽(Lvthy)基因进行克隆,并对其序列特征进行分析,并通过荧光定量PCR对其组织分布表达及低温胁迫下的表达谱进行分析,最后通过siRNA干扰的方法对其表达量进行敲降,对其在凡纳滨对虾低温胁迫下的功能进行验证。Lvthy基因cDNA全长1765 bp,开放阅读框长度729 bp,编码242个氨基酸。组织分布分析结果显示,Lvthy基因在对虾不同组织中均有表达,在胃组织中表达量最高,其次是在肠道、心脏和脑组织。低温胁迫试验结果显示:Lvthy基因在低温刺激1 h后表达量开始上调;3 h后表达量达到最高,是正常状态下的2.7倍;随后Lvthy基因表达量开始下降。RNAi干扰试验结果显示,敲降Lvthy基因后,凡纳滨对虾在低温胁迫下的存活率仅为31%,显著低于对照组存活率(83%)。试验结果表明,胸腺肽在凡纳滨对虾响应低温胁迫的生理过程中发挥重要的作用,本试验结果可为胸腺肽在甲壳动物应对低温胁迫下的适应机制研究奠定基础。

仿刺参β-胸腺素基因的克隆和表达分析

β-胸腺素是一种具有抗菌活性的多肽。采用RACE方法克隆仿刺参β-胸腺素(β-Thymosin),命名为Ajβ-Thymosin。Ajβ-Thymosin基因的序列全长1877 bp,开放阅读框为126 bp,编码41个氨基酸;分子质量为4.6 ku,理论等电点为5.25。仿刺参β-胸腺素中存在着保守的功能序列EVASFD-KSKLK和保守的G-actin结合结构域LKKTET。系统发育进化分析结果显示,仿刺参β-胸腺素和紫色球海胆的β-胸腺素聚为一支。采用实时荧光定量PCR检测Ajβ-Thymosin基因在仿刺参不同组织和不同发育时期的表达量,发现其在体腔细胞中的表达量最高,在小耳幼虫期开始高表达。经过假交替单胞菌、灿烂弧菌、蜡样芽孢杆菌和希瓦氏菌4种病原菌刺激后,仿刺参体腔细胞中Ajβ-Thymosin基因的表达量在4 h均受到抑制;在蜡样芽孢杆菌和希瓦氏菌组,Ajβ-Thymosin基因的表达量在12 h开始上调;在假交替单胞菌组,Ajβ-Thymosin基因的表达量在24 h开始上调;在灿烂弧菌组,Ajβ-Thymosin基因的表达量在48 h才开始上调。病原刺激产生的动态表达模式表明,Ajβ-Thymosin基因参与仿刺参体腔细胞免疫应答的过程,并且对不同病原菌的免疫应答能力不同。对Ajβ-Thymosin基因的序列和表达进行分析,可为新型抗菌肽和养殖病害防控策略的研发奠定基础。

胸腺肽基因对樱桃番茄的遗传转化

胸腺肽基因是一343bp的小肽基因,是从动物中克隆得到的。本文以"美味樱桃"番茄为植物材料,用农杆菌侵染法进行了胸腺肽基因的遗传转化。对所得再生植株进行了PCR和Southernblot检测及RT-PCR检测,34棵Kam抗性株通过目的基因PCR检测,4棵为阳性株,阳性株率为11.8%。实验中还对目的基因之后的Nos终止序列区进行了扩增,通过NosTer.引物对4株目的基因PCR阳性株作PCR检测,只有1株为阳性株,该植株经Southernblot检测和RT-PCR检测,均为阳性。这些检测结果说明胸腺肽基因成功地整合到番茄基因组中,并在转录水平上得以表达。

胸腺肽基因转化生菜及其表达的研究

以4d苗龄的美国大速生生菜无菌苗子叶为外植体,通过根癌农杆菌介导, 将胸腺肽基因(thy)导入生菜。研究结果表明,含有卡那霉素75 mg·L-1的MS1-1培养基(MS+0.1 mg·L-1 6-BA+0.05 mg·L-1NAA+Cb500 mg·L-1) 为最适子叶外植体转化后诱导芽再生的培养基,经抗性筛选,将抗性芽切下于MS1-2培养基(1/2MS + Kan50mg·L-1+Cb100 mg·L-1)上诱导生根。通过PCR和Southern杂交分析证明,胸腺肽基因已经整合到生菜基因组中。RT-PCR检测初步表明, 胸腺肽基因可以在生菜中正常转录。

胸腺素α_1 基因的克隆表达及其生物活性

胸腺素α1(thymosinalpha 1 ,Tα1)作为一种免疫增强剂 ,临床用途广泛 .为大量制备Tα1,按大肠杆菌惯用密码子合成Tα1基因 ,克隆于质粒pUC1 9的EcoRⅠ和PstⅠ位点 .经测序证明序列正确后 ,串联为 4串体 (Tα1④ ) ,经再次测序确认后克隆入pThioHisA的EcoRⅠ和PstⅠ位点 .转化大肠杆菌T0P1 0 ,酶切鉴定正确后 ,经 1mmol LIPTG诱导 4h ,获得硫氧还蛋白与Tα1④的融合表达 ,用离子交换层析纯化融合蛋白 .溴化氰裂解融合蛋白 ,释放出Tα1单体 ,经离子交换色谱纯化出Tα1.采用3 H TdR参入法进行生物活性测定 ,证实融合蛋白和Tα1均具有刺激小鼠脾淋巴细胞分裂增殖的能力 .

重组胸腺素α_1的克隆、表达与纯化

目的 利用基因工程方法表达重组胸腺素α1(Tα1) ,并进行纯化、鉴定。方法 使用大肠杆菌偏爱密码子 ,人工合成Ref蛋白 (T7噬菌体蛋白 )和Tα1的融合基因 ,并克隆在表达载体 pBV2 2 0中 ,转化E .coliDH5α ,温度诱导表达 ,表达的重组蛋白Ref Tα1经CM SepharoseFF阳离子柱进行纯化 ,Western blot进行鉴定。结果 获得了纯化的重组蛋白Ref Tα1,相对分子质量约为 15 0 0 0。结论 用融合基因的方法表达小分子多肽是一种可行的方法 ,Ref Tα1的成功表达为进一步研究其生物学活性奠定了基础。

人胸腺素α1原核表达重组体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 :以基因工程方法获得人胸腺素 α1 (Tα1 )多肽产品。方法 :通过 PCR扩增人工合成模板的方法获得人 Tα1基因 ,然后将其克隆入原核细胞表达载体 p GEMEX1 ,用重组体转化大肠杆菌 ,并从 m RNA和蛋白质水平检测重组体在大肠杆菌中的表达情况。结果 :构建了人 Tα1克隆重组体 p UC1 8-Tα1 ,经序列分析证实对码、序列无误 ;成功构建了人 Tα1原核细胞表达重组体 p GE-MEX1 -Tα1 ;从 m RNA水平证实 p GEMEX1 -Tα1在大肠杆菌 JM1 0 9(DE3)中能够转录 ;转化大肠杆菌 JM1 0 9(DE3) ,经 IPTG诱导 ,能产生一 36 k D左右的融合蛋白。结论 :构建成功重组体 p GE-MEX1 -Tα1 。

胸腺肽基因多元植物表达载体的构建

Gus基因是最为常用的报告基因之一,为了便于对胸腺肽目的基因进行检测,在该研究中,胸腺肽目的基因、PRIB分泌基因和GUS报告基因DNA片段用DNA纯化回收试剂盒回收,然后用T4 DNA连接酶连接,构建成几个基因相融合的多元植物表达载体,并通过酶切进行鉴定。用基因枪转化法对胡萝卜愈伤组织进行了遗传转化,转化的胡萝卜愈伤组织经Southern杂交检测和X-Gluc染色,结果表明,多元表达载体成功地被导入胡萝卜愈伤组织。

人胸腺素α_1基因工程菌的构建与表达

胸腺素α1(Thymosinalpha1,Tα1)是一种针对T淋巴细胞的免疫增强剂,临床用途广泛.为大量制备Tα1,按大肠杆菌惯用密码子合成编码Tα1的基因,克隆于pUCmT,转化E.coliJF1125,经测序证明序列正确后,克隆入pET39(b)的BspT 和BamH 位点,成功地构建出包含信号肽,DsbA,连接肽,6个His,EKsite(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys),胸腺素α1的表达载体,转化E.coliBL21(DE3),获得胸腺素α1基因工程菌.SDS-PAGE分析表明,经0.1mmol/LIPTG和30℃诱导8h,在大肠杆菌周质中大量表达表观分子量31kD左右的融合蛋白.为进一步获得大量可供实验研究和临床应用的重组胸腺素α1创造条件.

大鲵胸腺素β-4全长基因的分离与表达研究

【目的】对大鲵胸腺素β-4基因进行生物信息学分析和原核表达载体构建,为大鲵胸腺素β-4蛋白生理活性的深入研究奠定基础。【方法】从大鲵皮肤cDNA文库中分离获得了大鲵胸腺素β-4基因全长序列,采用多种生物软件对其进行生物信息学分析,用定量PCR研究胸腺素β-4基因在不同组织的表达情况,并以pET32a为载体构建该基因原核表达载体。【结果】胸腺素β-4基因全长共699bp,其中开放阅读框135bp,5′-UTR 87bp,3′-UTR为474bp,该基因编码45个氨基酸,表达蛋白的理论分子质量为5 141.59u,等电点为5.34;结构分析发现,大鲵胸腺素β-4蛋白氨基酸序列的第7～43位处有"THY"特征模体,没有跨膜螺旋区、细胞膜外在跨膜结构域。氨基酸序列进化关系表明,大鲵与人、大鼠、牛、猩猩、鸡、倭蛙等动物亲缘关系较近,氨基酸同源性高于85%;与猪和爪蟾的亲缘关系次之,氨基酸同源性均为83%;而与虹鳟、大菱鲆、斑马鱼等鱼类的亲缘关系较远,氨基酸同源性低于80%。荧光定量PCR检测结果表明,胸腺素β-4基因在大鲵肺中的相对表达量最高。SDS-PAGE电泳结果表明,构建的大鲵胸腺素β-4原核表达重组菌株pET32a-Tβ4,在37℃条件下,用终浓度1.0mmol/mL IPTG诱导4h后,大鲵胸腺素β-4基因获得了较高的表达。【结论】分离获得了大鲵胸腺素β-4基因全长cDNA序列,该基因氨基酸序列与人等高等动物的同源性最高,能在大鲵肺中及大肠杆菌中获得高效表达。

转胸腺素α1基因聚球藻抗氧化作用的研究

本试验室已在蓝藻聚球藻中高效表达了人源胸腺素α1(thymosinα1,Tα1)基因,为研究转Tα1基因聚球藻口服后的生物活性,本研究给小鼠灌服转Tα1基因聚球藻14d,研究其对小鼠谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(Cat)和超氧化物歧化酶(SOD)活力以及丙二醛(MDA)含量的影响,结果表明:转胸腺素α1基因聚球藻可显著提高小鼠心、肝与肾中GSH-Px活力(P<0.01);明显提高心脏Cat活性(P<0.01);显著降低肝脏中MDA的含量(P<0.01);但对SOD活力无明显作用。提示转胸腺素α1基因聚球藻较强的抗氧化作用。

串联的人胸腺素α1基因在番茄中的高效表达

【目的】提高免疫活性多肽人胸腺素α1(Tα1)在番茄中的表达量。【方法】根据植物偏爱密码子对Tα1基因进行优化,并将其顺式串联成四联体,同时在单体基因间插入肠激酶剪切位点基因序列,以便表达的融合蛋白可以被肠激酶切割成单体。利用农杆菌介导法将单体Tα1基因和四联体Tα1基因分别转化进入番茄。【结果】两个基因转化番茄后分别得到卡那霉素抗性再生植株19株和10株,PCR和Southern杂交检测证明,部分番茄基因组中整合了外源基因。经过Western和ELISA分析,串联的Tα1基因已经在番茄果实中表达,表达量最高相当于20.2μg T α1·g-1果实鲜重,高于单体基因的表达量。【结论】基因串联的方式提高了Tα1基因在番茄中的表达量。

重组胸腺素α_1的克隆、表达与纯化

目的 利用基因工程方法表达胸腺素α1 (thymosinalpha1,Tα1 )的串联体并进行纯化、鉴定 .方法 将 Tα1 的基因拆分为 4个片段进行合成 ,退火后经 PCR获得串联体基因 ,测序正确后克隆在硫氧还蛋白 (thioredoxin)融合蛋白表达载体 p Thio His A中 ,转化大肠杆菌 TOP10菌株 ,IPTG诱导表达 ,表达的融合蛋白经过 80℃热处理及阴离子交换柱Q- Sepharose Fast Flow进行纯化 ,Western- blot进行鉴定 .结果 获得了纯化的 Thioredoxin- Tα1 3,分子质量约为 31ku.结论 用基因串联思路表达小分子多肽是一种可行的方法 ,Tα1

胸腺素α1/干扰素α-2b融合基因表达载体的构建与表达

通过PCR人工合成模板的方法获得牛Tα1基因,与含IFNα-2b基因的pAG-IFN重组质粒,构建Tα1/IFNα-2b融合基因重组质粒pUC18-Tα1/IFN,经序列分析证实,融合基因Tα1和IFNα-2b与GenBank登录基因的序列一致性分别为100%和98.5%,仅IFNα-2b有两处碱基发生无义突变.再将融合基因亚克隆入pBV220,构建融合表达载体pBV220-Tα1/IFN,转化到E.coliM15经IPTG诱导,实现了Tα1-IFNα-2b融合蛋白的高表达,约占菌体总蛋白的24.5%,为包涵体形式.这为研制Tα1-IFNα-2b双重活性的融合蛋白奠定了基础.

天然胸腺素α_1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的为降低CNBr裂解融合蛋白的毒副作用 ,改进利用基因重组技术制备胸腺素α1 (Tα1 )的流程工艺。方法按大肠杆菌惯用密码合成Tα1 基因 ,克隆于质粒pGEM 3Zf的EcoRⅠ和PstⅠ位点 ,裂解位点为羟胺裂解位点Asn Gly对应的核苷酸序列 ,测序正确后用BamHⅠ和BglⅡ位点串联为Tα1 4串体 (Tα1 ④ )和Tα1 8串体 (Tα1 ⑧ ) ,经再次测序确认后克隆入pThioHisA的EcoRⅠ和PstⅠ位点 ,转化大肠杆菌TOP1 0。结果经 1mmol LIPTG诱导4h获得了硫氧还蛋白 (thioredoxin)与Tα1 ④和Tα1 ⑧的融合表达 ,用离子交换色谱可纯化出融合蛋白 ,羟胺裂解融合蛋白 ,能够释放出Tα1 单体。结论羟胺能够裂解融合蛋白释放出天然Tα1 。

重组人胸腺法新的制备及其作为老年人流感疫苗免疫增强剂的效果评价

目的采用重组技术制备重组人胸腺法新(rh Tα1),初步探讨rh Tα1对老年小鼠接种流感疫苗免疫应答效果的影响。方法用DNA重组技术构建胸腺法新的原核表达载体p GE-Tα1,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21中,经高密度发酵和纯化成功制备rh Tα1。老年Balb/c小鼠接种流感疫苗后,随机分为实验组和对照组,实验组给予低、中、高剂量(0.2、0.4、0.8 mg/kg)的rh Tα1,对照组给予PBS(阴性对照组)和化学合成的胸腺法新(c Tα1 0.4 mg/kg,阳性对照组),皆皮下注射,每周2次,连续4周。动态监测小鼠血清中的血凝抑制(HI)抗体效价,采用MTT法测定小鼠脾脏T、B淋巴细胞转化功能、使用ELISA方法检测血清细胞因子水平(IL-12,IFN-γ),并观察脾脏形态学结构的变化。结果 rh Tα1的表达载体构建成功,经发酵和纯化获得纯度>95%的目的蛋白;动物实验显示,与阴性对照组比较,rh Tα1各浓度组与c Tα1组均能提高老年鼠的HI抗体效价,提高脾脏T、B淋巴细胞转化功能以及血清中IL-12、IFN-γ的表达水平,脾脏组织病理形态明显改善,而且rh Tα1中高剂量组与c Tα1组效果相近(P>0.05)。结论使用DNA重组技术成功制备rh Tα1,且rh Tα1能够提高老年小鼠流感疫苗接种的免疫效果,为开发适合老年人的疫苗免疫应答增强剂提供了理论基础。

胸腺素β4对大鼠急性心肌梗死后心功能的影响

目的探讨慢病毒介导的胸腺肽β4基因经梗死区直接注射对大鼠急性心肌梗死后心功能的影响。方法雄性SD大鼠32只,随机分为4组,每组8只。假手术组:开胸+不结扎冠状动脉,心肌内分五点注射生理盐水50μl;生理盐水组:开胸+冠状动脉左前降支结扎,梗死区心肌内注射等量生理盐水50μl;胸腺肽β4组:开胸+冠状动脉左前降支结扎,梗死区心肌内注射pGC-FU-胸腺肽β4 50μl;空载病毒组:开胸+冠状动脉左前降支结扎,梗死区心肌内注射空载病毒50μl。4周后,大鼠心脏超声测定心功能,Western blot法检测胸腺肽β4和血管内皮生长因子蛋白的表达,RT-PCR法检测胸腺肽β4基因的表达。结果胸腺肽β4组LVEF较生理盐水组和空载病毒组明显提高(P<0.01)。胸腺肽β4组心肌组织中胸腺肽β4和血管内皮生长因子蛋白表达较假手术组、生理盐水组和空载病毒组明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论经梗死区直接注射慢病毒载体携带的胸腺肽β4基因可以改善心肌梗死后的心功能。

基因串联原核高效表达胸腺肽α1

人工合成含有SD序列、胸腺肽α1(Tα1)基因、纯化标签和酶切位点的DNA序列作为构建元件,利用同尾酶将其依次克隆到pET-32a(+)中,得到含有1～8个不同重复数目的含SD序列基因的串联表达载体,利用PCR初步鉴定和进一步的测序证实序列完全正确。进而利用lacZ基因作为指示基因,将带有SD序列的lacZ基因克隆到不同Tα1基因串数载体末尾,利用蓝白斑实验验证启动子后不同SD序列的效率,证实串联载体中的各个SD序列均能有效启动翻译。在此基础上对各串表达载体进行摇瓶发酵,SDS-PAGE电泳检测证实各串均可正确表达Tα1,且为可溶性表达,为小肽原核高效表达提出了新方法,有望成为小肽高效表达的新途径。

家蚕胸腺素对蚕体抗核型多角体病毒感染能力的影响

胸腺素（THY）在动物进化过程中高度保守,并在许多生命活动中发挥重要作用。将家蚕核型多角体病毒（Bm NPV）感染家蚕5龄幼虫后,分别提取蚕体及不同组织的RNA和蛋白质,检测Bm THY基因的转录及蛋白质表达的变化,并探究利用重组胸腺素r Bm THY增强家蚕抗病毒能力的可行性。qRT-PCR检测结果表明,感染Bm NPV后的家蚕5龄幼虫,其血淋巴、脂肪体、丝腺和气管中的Bm THY基因mRNA转录水平不同程度上调,而马氏管、中肠和头部组织中Bm THY基因mRNA转录水平则呈下调趋势;Western blotting检测家蚕5龄幼虫感染Bm NPV后72 h,蚕体内Bm THY蛋白的表达水平下降42.3%。家蚕5龄幼虫接种Bm NPV后,分别添食质量浓度为340μg/m L（高剂量）、34μg/m L（中剂量）和3.4μg/m L（低剂量）的r Bm THY溶液,调查3组幼虫的发病率为43.8%、54.0%和57.6%,而对照组幼虫分发病率为62.2%。研究结果初步证明Bm NPV感染可降低蚕体及部分组织中Bm THY的基因转录与蛋白质表达水平,高剂量r Bm THY添食处理可以在一定程度上提高家蚕抗Bm NPV病毒感染的能力。