胶质瘤组织中TRIP4和DDIT4水平表达及其与临床病理特征和预后的关系

目的研究胶质瘤组织中甲状腺激素受体结合蛋白4(thyroid hormone receptor interacting protein 4,TRIP4)和DNA损伤诱导转录因子4(DNA damage inducing transcription factor 4,DDIT4)水平表达及其与临床病理特征和预后的关系。方法选取2018年2月~2019年2月河北医科大学第一医院收治的94例胶质瘤患者为研究对象。应用免疫组织化学法检测组织中TRIP4和DDIT4蛋白表达。比较不同临床病理特征脑胶质瘤组织中TRIP4和DDIT4蛋白表达。采用Kaplan-Meier生存曲线分析不同TRIP4和DDIT4蛋白表达胶质瘤患者生存预后的差异。单因素和多因素COX回归分析影响胶质瘤患者生存预后的因素。结果胶质瘤组织中TRIP4(68.09%)和DDIT4(65.96%)蛋白阳性率高于瘤旁组织(13.83%,10.64%),差异具有统计学意义(χ^(2)=57.212,60.866,均P<0.05)。胶质瘤组织中TRIP4与DDIT4蛋白表达呈显著正相关性(r=0.722,P<0.05)。WHO分级Ⅲ级、肿瘤直径≥3cm胶质瘤组织中TRIP4和DDIT4蛋白阳性率均高于WHO分级Ⅰ~Ⅱ级、肿瘤直径<3cm胶质瘤组织,差异具有统计学意义(χ^(2)=6.393~14.754,均P<0.05)。TRIP4阳性表达组和阴性表达组三年总体生存率分别为37.50%(24/64),66.67%(20/30),TRIP4阳性表达组三年累积生存率低于阴性表达组,差异具有统计学意义(Log-rankχ^(2)=5.949,P=0.015)。DDIT4阳性表达组和阴性表达组三年总体生存率分别为37.10%(23/62),70.00%(21/30),DDIT4阳性表达组三年累积生存率低于阴性表达组,差异具有统计学意义(Log-rankχ^(2)=7.642,P=0.006)。肿瘤直径≥3cm(HR=1.614,P=0.000),WHO分级Ⅲ级(HR=1.790,P=0.000),TRIP4阳性表达(HR=1.665,P=0.000),DDIT4阳性表达(HR=1.476,P=0.000)是影响胶质瘤患者生存预后的独立危险因素。结论胶质瘤组织中TRIP4和DDIT4蛋白表达升高,两者与肿瘤直径及WHO分级相关,是潜在的评估胶质瘤预后的肿瘤标志物。

TRIP3基因与儿童急性白血病免疫分型关系的研究

目的研究TRIP3(thyroid hormone receptor interacting protein 3)基因在儿童急性白血病中的表达,探讨其与儿童急性白血病免疫分型关系。方法采用逆转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)及流式细胞仪检测检测39例儿童急性白血病的免疫表型及TRIP3基因水平,并分析二者的关系。结果 TRIP3基因在儿童急性淋巴细胞白血病与儿童急性非淋巴细胞白血病中的表达水平无明显差异(P>0.05);TRIP3在不同类型儿童急性淋巴细胞白血病中表达情况不同,31例初治患者,B-ALL21例,TRIP3阳性13例,阳性率为61.9%,T-ALL7例,TRIP3阳性2例,阳性率为28.5%,二者差异显著(P<0.05),且B-ALL TRIP3表达水平高于T-ALL(P<0.05)。结论 TRIP3基因在B系淋巴细胞白血病表达水平高,检测TRIP3基因可以估计急性淋巴细胞白血病的临床预后。

甲状腺激素受体结合蛋白3基因在儿童急性淋巴细胞白血病中的表达及意义

目的研究甲状腺激素受体结合蛋白3(TRIP3)基因在急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿中的表达,探讨其与儿童ALL缓解的关系。方法采集空腹静脉血2～4mL,依地酸(EDTA)抗疑,采用Ficoll密度梯度离心法收集单个核细胞,Trizol试剂一步法提取总RNA。采用反转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)检测73例不同阶段ALL及20例健康儿童外周血单个核细胞TRIP3基因表达水平,并分析其与儿童ALL缓解的关系。结果1.TRIP3基因在ALL初治及复发组的表达水平均明显低于健康对照组(Pa<0.01);在完全缓解的ALL患儿中的表达水平明显高于健康对照组(P<0.01);2.TRIP3基因在初治组与复发组ALL中的表达水平无明显差异(P>0.05);在缓解组表达水平明显高于复发及初治组(Pa<0.01);3.在初治的ALL患儿中,TRIP3基因表达阴性者其治疗后完全缓解率明显低于TRIP3基因表达阳性者(缓解率分别为25.0%vs84.2%,P<0.05)。结论TRIP3基因与儿童ALL的缓解有一定关系,其表达水平可作为评价ALL患儿化疗效果及评估预后的指标之一。

沉默TRIP13位点对慢性淋巴细胞白血病患者细胞株生物学影响及通路机制

目的探讨甲状腺激素受体相互作用蛋白13(TRIP13)位点对慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者细胞株生物学影响及通路机制。方法选择2013年至2018年我院收治的80例门诊为CLL的患者设为研究组,同时选取同期80例体检健康者作为对照组。比较两组患者静脉血中CD19^+B淋巴细胞TRIP13信使核糖核酸(mRNA)相对表达量、干扰靶点TRIP13蛋白敲减效率及TRIP13干扰后JVM-2细胞凋亡率,观察JVM-2细胞慢病毒感染情况、TRIP13干扰后JVM-2细胞增殖能力及对凋亡相关蛋白的影响。结果研究组TRIP13mRNA相对表达量明显高于对照组(P<0.05);TRIP13干扰5d内干扰组JVM-2细胞增殖能力明显低于对照组(P<0.05);TRIP13干扰后干扰组JVM-2细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.05);TRIP13干扰后干扰组较对照组JVM-2细胞中B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、髓细胞增生原癌基因(Myc)蛋白表达下调,活化半胱胺酸蛋白酶蛋白-3(Caspase-3)表达上调(P<0.05)。结论 CLL患者体内TRIP13水平升高,TRIP13基因通过调控Bcl-2、Myc及Caspase-3信号通路诱导体内Bcl-2、Myc蛋白表达下调,Caspase-3蛋白表达上调,有望成为治疗CLL新的靶点。

RIPK3过表达对mTOR及其相关基因转录的调控作用

目的探索受体相互作用蛋白激酶3(receptor-interacting protein kinase 3,RIPK3)的下游信号通路。方法向实验组SH-SY5Y细胞内转染pCMV6-RIPK3质粒上调细胞内RIPK3的表达水平,对照组细胞转染相应的空载质粒。通过Western blot检测细胞内RIPK3的表达水平。3-(4,5-二甲基噻唑)[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl),MTT]实验获得2组细胞增殖曲线确定外源性RIPK3在细胞内具有的生物学活性。通过RNAseq检测2组细胞基因转录差异,并在生物通路分析(ingenuity pathway analysis,IPA)数据库中进行数据分析,获得RIPK3的下游信号通路及其中的关键分子哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)。采用微滴式数字化PCR(droplet digital PCR,ddPCR)对mTOR转录水平的差异进行验证。结果质粒DNA整合到细胞基因组内,Western blot提示外源性RIPK3在实验组细胞内稳定表达,MTT结果证明其在细胞内能够抑制细胞增殖。RNAseq及IPA分析结果提示过表达RIPK3能够导致mTOR转录水平发生上调,并对其下游的基因,包括固醇反应结合蛋白(sterol-response binding proteins,SREBPs)、p70核糖体S6蛋白激酶(p70ribosomal S6protein kinases,S6K)、真核生物起始因子4E结合蛋白(eukaryotic initiation factor 4E-binding proteins,4E-BPs)和ULK(unc-51-like kinase)激酶复合体的转录具有明显的调节作用。ddPCR实验结果中mTOR表达改变趋势与RNAseq基本一致。结论 RIPK3能够调控mTOR及其下游信号通路中SREBPs、S6K、4E-BPs和ULK基因转录水平,进而在神经系统生长发育和疾病进展中发挥重要作用。

胰岛素样生长因子结合蛋白-3与甲状腺激素受体α1的相互作用及其对甲状腺激素应答性基因转录的调节

目的探讨胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)与甲状腺激素受体α1(TRα1)之间的相互作用,及其对甲状腺激素应答性基因转录作用的调节。方法采用谷胱甘肽-S-转移酶拉下实验、免疫共沉淀以及荧光共振能量转移实验检测IGFBP-3与TRα1之间的相互作用;激光共聚焦显微镜观察两种蛋白在细胞中的分布;采用双萤光素酶实验检测过表达IGFBP-3对甲状腺素T3激活的生长激素启动子的影响。结果谷胱甘肽-S-转移酶拉下实验、免疫共沉淀以及荧光共振能量转移实验结果证明IGFBP-3与TRα1在体内和体外都可以相互作用,激光共聚焦显微镜观察IGFBP-3和TRα1可以共定位于HEK-293细胞的细胞核。通过双萤光素酶实验检测到过表达IGFBP-3可以抑制甲状腺激素对生长激素启动子的激活作用(P<0.01)。结论 IGFBP-3通过与TRα1相互作用抑制甲状腺激素应答性基因的转录,为IG-FBP-3在核内发挥胰岛素样生长因子非依赖的作用提供了新的实验依据。

SH-SY5Y细胞中过表达RIPK3对ZFP36基因转录的影响

目的探讨SH-SY5Y细胞中受体相互作用蛋白激酶-3(RIPK3)下游信号通路及其中的关键信号分子的作用。方法通过质粒转染的方式在实验组SH-SY5Y细胞内表达外源性RIPK3蛋白,将转染空载质粒载体SH-SY5Y细胞作为对照组。通过观察质粒所携带的绿色荧光蛋白(GFP)在细胞中的表达情况以验证转染结果,Westernblot对外源性RIPK3表达进行验证。MTT法检测细胞增殖活性,观察过表达RIPK3对细胞活性的影响,以确认其在细胞内是否具有生物活性。运用转录组测序技术(RNAseq)分别检测2组细胞内基因转录丰度并应用IngenuityPathway Analysis(IPA)数据库进行分析,获得RIPK3下游信号通路及关键分子。通过微滴式数字化PCR(dd PCR)对部分RNAseq结果进行验证。结果外源性RIPK3在细胞内具有生物活性,能够抑制SH-SY5Y细胞的增殖。RNAseq数据经IPA分析后得出锌指蛋白36(ZFP36)为RIPK3下游效应分子,其相关效应分子包括血管内皮生长因子(VEGF)、人脱帽酶2(DCP2)、脑源性神经营养因子(BDNF)、肿瘤坏死因子(TNF)的转录丰度也发生了相应的变化。结论 RIPK3能够参与对ZFP36以及与其相关效应分子的转录调控,进而在神经系统的发育、炎症和肿瘤发生等生理、病理过程中发挥重要作用。

文蛤甲状腺激素受体MmTR互作蛋白筛选及其对Aroclor 1254胁迫的转录响应研究

环境中存在的甲状腺干扰物(thyroid disrupting chemicals,TDCs)可影响生物体内甲状腺激素(thyroid hormone,THs)的合成、分泌、转运、代谢和作用等过程,干扰THs稳态,引起THs水平失衡。甲状腺激素受体(thyroid hormone receptors,TRs)是一种存在于细胞核内的DNA结合转录因子,属于配体依赖型核激素受体超家族。TRs可与甲状腺激素响应元件(thyroid hormone response elements,TREs)结合,调控其转录表达。TDCs可作为生物体内TRs的配基,竞争性地与TRs结合,进而激活甲状腺信号通路,调控机体的整个甲状腺信号通路基因的转录表达。为探究TDCs对海洋无脊椎动物体内甲状腺激素是否具有干扰效应及其机制,本文通过构建文蛤消化盲囊组织酵母双杂交cDNA文库和文蛤甲状腺激素受体TR基因的诱饵载体pGBKT7-MmTR,在文库内进行MmTR的互作蛋白筛选和鉴定。结果表明,文蛤消化盲囊酵母双杂交cDNA文库中,cDNA片段大小在0.5~2 kb之间,库容约>2×10^(6) cfu。重组质粒pGBKT7-MmTR诱饵载体无毒性和自激活活性,可应用于酵母双杂交系统。经文库筛选共得到36个阳性克隆子,测序获得30个阳性克隆片段。随机选取BIRC2_3与MmTR基因进行点对点验证,结果为阳性,推测所有结果真实可靠。经比对分析,MmTR的29个潜在互作蛋白,功能涉及生长与发育过程、蛋白质代谢与免疫调控过程、应激响应过程和转录调控过程。不同浓度Aroclor 1254胁迫下幼体及成体文蛤体内MmTR基因潜在互作蛋白基因的转录响应分析发现,大多数潜在互作蛋白基因会对低浓度(10 ng·L^(-1)和20 ng·L^(-1))的Aroclor 1254短时间(1 d)暴露产生转录上调响应,且在成体阶段相关基因的转录响应更强烈;与成体阶段相比,文蛤幼体阶段暴露于高浓度(2000 ng·L^(-1))的Aroclor 1254中,生长与发育、蛋白质代谢与免疫调控过程相关的MmTR潜在互作蛋白基因RSPH9、N23、ferritin、BHMT、SCC4、PSMB5具有更明显的上调表达趋势;在成体文蛤体内,未知蛋白基因和位置功能蛋白基因的表达更易受到Aroclor 1254胁迫的影响。本研究结果为深入研究TDCs对无脊椎动物甲状腺激素的作用奠定基础,并且对海洋环境的保护有重要意义。

乳腺癌组织中miR-216a-5p、TRIP4表达与患者病理特征和预后的关系

目的探讨乳腺癌组织中微小RNA(miRNA)-216a-5p、甲状腺激素受体相互作用蛋白4(TRIP4)表达与患者病理特征和预后的关系。方法选取85例乳腺癌患者,采用qRT-PCR法检测癌组织和癌旁组织中miR-216a-5p、TRIP4表达,并分析二者与患者临床病理特征的关系。随访3年,以二者均值将患者分为miR-216a-5p高表达组(≥0.430,44例)和miR-216a-5p低表达组(<0.430,41例),TRIP4高表达组(≥1.886,42例)和TRIP4低表达组(<1.886,43例),比较不同表达患者预后情况。结果乳腺癌、癌旁组织中miR-216a-5p相对表达量分别为0.430±0.109、1.012±0.166,TRIP4相对表达量分别为1.886±0.388、1.023±0.171,乳腺癌、癌旁组织中miR-216a-5p、TRIP4表达比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。乳腺癌组织中miR-216a-5p与TRIP4表达呈负相关(r=-0.637,P<0.05),二者与人表皮生长因子受体-2(HER-2)表达、Ki-67增殖指数、TNM分期、淋巴结转移有关(P均<0.05)。miR-216a-5p高表达组3年无进展生存率、总生存率高于miR-216a-5p低表达组,而TRIP4高表达组3年无进展生存率、总生存率小于TRIP4低表达组(P均<0.05)。结论乳腺癌组织中miR-216a-5p低表达,TRIP4高表达,二者与HER-2表达、Ki-67增殖指数、TNM分期、淋巴结转移和预后有关。

甲状腺激素受体相关蛋白15的研究进展

甲状腺激素受体相关蛋白15(TRIP15)是一个核受体家族的选择性转录共抑制子,参与构成COP9信号复合体,调节机体蛋白质的降解。TRIP15与涉及转录调节、细胞周期调控、DNA损伤修复的多种生物大分子相互作用,参与细胞增殖、分化、凋亡等重要生理过程,其表达调控的信号通路与肿瘤、脂质代谢紊乱及内分泌疾病的发生与发展密切相关。TRIP15具有复杂的蛋白质相互作用网络及多样的生物学功能,可能会成为疾病治疗的新靶点。

利用CRISPR/Cas9系统构建HepG2细胞THRAP3基因敲除细胞系

目的使用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除人类肝癌细胞HepG2中的甲状腺激素受体相关蛋白3(THRAP3)基因,构建THRAP3基因敲除细胞系。方法根据CRISPR/Cas9靶点设计规则,设计特异性靶向THRAP3基因第3个外显子相关序列的多条小向导RNA,通过T7核酸内切酶筛选出切割效率最高的载体,构建pSpCas9-THRAP3真核重组表达质粒。测序鉴定后,将重组质粒转染至HepG2细胞中,用嘌呤霉素(puromycin)抗性筛选细胞株,挑取单克隆,再用PCR、测序等方法鉴定细胞基因型,免疫印迹方法鉴定细胞THRAP3敲除效果。使用高通量测序的方法进行基因表达分析。用流式细胞仪检测基因敲除对细胞周期的影响,CCK-8试剂盒检测细胞增殖。结果成功构建pSpCas9-THRAP3真核重组表达质粒,筛选出特异性敲除THRAP3基因的细胞系,验证了THRAP3敲除对细胞周期以及细胞增殖的影响。结论利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建并获得了THRAP3基因敲除细胞系并初步探究了THRAP3基因功能。

人垂体生长激素腺瘤临床生化特征与芳香烃基受体相互作用蛋白基因表达的相关性

目的 探讨芳香烃基受体相互作用蛋白（AIP）基因在国人垂体生长激素腺瘤中的体细胞突变与临床生化特征相关性.方法 收集96例垂体生长激素腺瘤患者的肿瘤标本进行检测,分析临床随访资料.结果 在对55例（57.3％）肿瘤标本中测序发现13个突变位点,其中,c.609C ＞G,c.646-38C＞T,c.646-35C＞T,c.646-34A＞T和c.692C＞T 5种类型尚未在国家生物技术信息中心（NCBI）单核苷酸多态性（SNP）数据库中报道过,为新发现AIP基因突变位点.AIP基因突变与患者起病年龄、肿瘤最大直径、肿瘤侵袭性以及是否为复发肿瘤明显相关.在AIP基因突变组中,患者起病年龄明显偏低,比较于未突变组肿瘤体积更大、侵袭性更强、术后更容易复发.结论 在散发性生长激素腺瘤中,AIP基因突变检测可能对患者预后的判断、治疗策略的制定,以及随访就诊有指导意义.