液相色谱串联质谱法测定大鼠血浆中知母皂苷A-Ⅲ质量浓度及其药物代谢动力学研究

目的建立测定大鼠血浆中知母皂苷A-Ⅲ(TA-Ⅲ)的液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)法,并考察其药物代谢动力学(PK)特征。方法色谱柱为Agilent XDB-C_(8)柱(150 mm×2.1 mm,5μm),流动相为乙腈-2 mmol/L乙酸铵(55∶45,V/V),流速为250μL/min,柱温为35℃,进样量为5μL;采用电喷雾离子源,以负离子多离子反应监测方式进行检测。将12只大鼠随机分为知母单煎液组和知母-黄柏(1∶1,m/m)合煎液组,各6只,采用建立的LC-MS/MS法测定两组大鼠血浆中TA-Ⅲ的浓度(以人参皂苷Rg_(2)为内标)。结果TA-Ⅲ质量浓度在0.3~3000 ng/mL范围内与TA-Ⅲ和内标峰面积比值线性关系良好,定量下限为0.3 ng/mL,精密度、准确度、提取回收率、基质效应、残留效应、稳定性试验结果均符合方法学要求。与知母单煎液组比较,知母-黄柏(1∶1,m/m)合煎液组大鼠TA-Ⅲ的血药浓度-时间曲线下面积增大,0-∞的平均滞留时间(MRT_(0-∞))和消除半衰期(t_(1/2))均显著延长(P<0.01)。结论该方法操作简便、结果准确可靠,可用于测定大鼠体内TA-Ⅲ的血药浓度。知母-黄柏(1∶1,m/m)合煎液促进了TA-Ⅲ的吸收,可延长其MRT_(0-∞)和t_(1/2)。

miR-27a-3p抑制β-1,4-半乳糖基转移酶Ⅲ表达对胃癌SGC-7901细胞的影响

目的目前关于胃癌中miRNAs靶向调控β-1,4-半乳糖基转移酶Ⅲ(B4GALT3)表达的具体机制尚不明确。文中旨在分析miR-27a-3p对胃癌SGC-7901细胞增殖、迁移及侵袭的影响,探讨其分子机制。方法生物信息学预测B4GALT3基因的靶miRNAs,针对B4GALT3′UTR与靶miRNA结合位点构建荧光素酶报告基因载体,检测其相对荧光素酶的活性;将miR-27a-3p mimic、mimic NC、control(空白对照)、miR-27a-3p inhibitor、inhibitor NC分别瞬转入SGC-7901细胞后,Western blot检测各转染细胞B4GALT3的表达情况;采用MTT、迁移、侵袭实验检测细胞的增殖、迁移、侵袭能力。结果与正常胃黏膜GES-1细胞比较,B4GALT3在胃癌各个细胞系中表达显著上调(P<0.05)。双荧光素酶报告基因检测结果显示,miR-27b-3p能使野生型B4GALT3的荧光素酶的活性显著性降低(P<0.001),说明miR-27a-3p与B4GALT3存在靶向关系。Western blot检测结果显示,瞬转miR-27a-3p mimic后,B4GALT3蛋白水平下降(P<0.05);瞬转miR-27a-3p inhibitor后,B4GALT3表达升高(P<0.01),说明miR-27a-3p对B4GALT3有负性调控作用。24、48、72、96、120 h,与mimic NC、空白对照比较,miR-27a-3p mimic的细胞增殖显著升高(P<0.05);与inhibitor NC、空白对照比较,miR-27a-3p inhibitor的细胞增殖显著降低(P<0.05)。miR-27a-3p mimic的迁移细胞数量[(319.3±13.9)个]较mimic NC[(218.0±10.7)个]明显增加(P<0.000);侵袭细胞数量[(402.0±15.0)个]较mimic NC[(241.0±17.3)个]明显增加(P<0.000)。miR-27a-3p inhibitor迁移细胞数量[(115.6±13.8)个]较inhibitor NC[(214.6±6.8)个]明显减少,迁移能力明显降低(P<0.000)。结论miR-27a-3p通过抑制B4GALT3表达,促进胃癌SGC-7901细胞增殖、迁移和侵袭能力,为寻找胃癌治疗靶点提供了实验依据。

基于网络药理学探讨知母皂苷A-Ⅲ抗鼻咽癌的作用机制

目的通过网络药理学探讨知母皂苷A-Ⅲ抗鼻咽癌(NPC)的作用靶点及分子机制。方法利用Swiss Target Prediction数据库获取知母皂苷A-Ⅲ作用靶点,通过GeneCards数据库检索NPC相关疾病靶点,将其与知母皂苷A-Ⅲ作用靶点映射,使用Cytoscape 3.6.1软件构建知母皂苷A-Ⅲ-鼻咽癌疾病靶点网络图,并运用DAVID数据库进行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析。结果获得知母皂苷A-Ⅲ抗鼻咽癌的潜在靶点31个,化合物-关键靶点-通路网络图显示关键靶点主要包括PRKCA、IGF1R、VEGFA和KDR等。GO功能富集分析获得分子功能条目13个、生物过程条目55个和细胞组成条目10个,KEGG通路富集得到20条相关通路,涉及蛋白多糖通路、癌症信号通路和PI3K-Akt信号通路等信号通路。结论基于网络药理学多靶点、多通路的整体作用特点,预测了知母皂苷A-Ⅲ抗鼻咽癌的作用靶点和潜在作用机制,以期为下一步实验研究提供科学依据。

知母皂苷A-Ⅲ调控ASAP1-IT1/DNMT3b/YAP1轴在非小细胞肺癌中的作用机制研究

目的:研究知母皂苷A-Ⅲ(timosaponin A-Ⅲ,TAⅢ)对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)生长的影响及其作用机制。方法:采用不同浓度TAⅢ(5、10、15、20、25、30μmol/L)处理非小细胞肺癌细胞A549,使用CCK8法检测细胞活力。以定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测二磷酸腺苷核糖化因子鸟苷酸激酶1-内含子转录因子1(adenosine diphosphate ribosylation factor guanylate kinase 1-intronic transcript 1,ASAP1-IT1)、Yes相关蛋白1(Yes-associated protein 1,YAP1)在组织及细胞中的表达。以EDU、流式细胞术和Western blot检测ASAP1-IT1、DNA(胞嘧啶-5-)-甲基转移酶3β(DNA(cytosine-5-)-methyltransferase 3 beta,DNMT3b)、YAP1对细胞增殖情况、细胞凋亡率及其相关基因(Bax和caspase-3)与抗凋亡基因Bcl2的影响。亚硫酸氢盐测序聚合酶链式反应(Bisulfite sequencing PCR,BSP)分析检测ASAP1-IT1与YAP1的关系。RNA免疫沉淀法(RNA binding protein immunoprecipitation,RIP)和qRT-PCR法检测ASAP1-IT1与DNMT3b之间的相互作用。免疫共沉淀实验(Co-immunoprecipitation,Co-IP)检测DNMT3b与YAP1之间的关系。采用qRT-PCR方法检测TAⅢ对ASAP1-IT1/DNMT3b/YAP1轴相关基因表达的影响。结果:ASAP1-IT1和YAP1在NSCLC组织和A549细胞中表达上调,而DNMT3b表达下调,加入TAⅢ可逆转这些效应。沉默ASAP1-IT1和YAP1、过表达DNMT3b或应用TAⅢ可增加A549细胞凋亡率和细胞凋亡相关指数。TAⅢ有逆转沉默或过表达ASAP1-IT1、DNMT3b和YAP1的作用。最后发现ASAP1-IT1与DNMT3b相互作用,而DNMT3b与YAP1相互作用。结论:ASAP1-IT1/DNMT3b/YAP1轴通过调节细胞增殖和凋亡促进NSCLC进展。TAⅢ通过调节ASAP1-IT1/DNMT3b/YAP1轴抑制肺癌细胞增殖,促进其凋亡。

HPLC法测定知母中知母皂苷BⅢ的含量

目的:建立 HPLC 法测定知母药材中知母皂苷 BⅢ含量。方法:采用 Agilent C_(18)柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为乙腈-水(26:74),检测波长为210 nm,流速为1.0 mL·min^(-1),柱温为33℃。结果:知母皂苷 BⅢ在18.4～172.5μg·mL^(-1)内呈良好的线性关系(r=0.9998),平均回收率为100.4%(n=6)。结论:本法可用于知母皂苷 BⅢ的定量分析。

高效液相色谱-蒸发光散射检测器法测定黄连清胃丸中栀子苷、知母皂苷AⅢ和知母皂苷BⅡ的含量

目的：应用高效液相色谱-蒸发光散射检测器（HPLC—ELSD）法测定黄连清胃丸中栀子苷、知母皂苷AⅢ和知母皂苷BⅡ的含量。方法：采用C18色谱柱（4．6mmX250mm，5μm）；流速为0．9ml／min；乙腈-水（30：70）为流动相；ELSD漂移管温度为90℃；载气（M）流速为2．9SLPM／min。结果：栀子苷、知母皂苷AⅢ和知母皂苷BⅡ进样量分别在0．0618—1．2360μg（r=0．9992）、0．0476～0．9520μg（r=0．9997）和0．1842～3．6840μg（r=0．9993）时进样量的自然对数值与峰面积的自然对数值呈良好的线性关系，平均加样回收率分别为97．67％、98．18％和98．36％，RSD分别为1．09％、1．01％和0．98％（n=6）。结论：本方法测定结果准确、灵敏、重复性好。

miR-27a-3p通过Wnt3a/β-catenin信号通路抑制肺成纤维细胞I、III型胶原合成

目的探讨microRNA-27a-3p(miR-27a-3p)对肺成纤维细胞I型胶原(ColⅠ)和III型胶原(ColⅢ)合成的影响及分子机制。方法培养人胚肺成纤维细胞MRC-5,转染miR-27a-3p模拟物/抑制物,实时荧光定量PCR(qPCR)检测miR-27a-3p水平;qPCR和Western blot测定ColⅠ、ColⅢ、Wnt3a表达;Western blot分析细胞核内β-catenin水平。生物信息学预测miR-27a-3p与Wnt3a 3′-非翻译区(3′-UTR)靶向结合情况,并用双荧光素酶报告基因检测miR-27a-3p模拟物对Wnt3a 3′-UTR野生型和突变型荧光素酶活性的影响。给予Wnt3a/β-catenin信号通路抑制剂Dkk1预处理MRC-5细胞6 h,再用miR-27a-3p抑制物转染细胞48 h,qPCR和Western blot检测ColⅠ、ColⅢ表达。结果 miR-27a-3p模拟物明显增加miR-27a-3p水平,降低ColⅠ、ColⅢ、Wnt3a和β-catenin表达,其抑制物的作用则相反,与对照组比较,差异均有显著性(P<0.01)。Wnt3a 3′-UTR存在1个miR-27a-3p的结合位点,miR-27a-3p过表达减少野生型Wnt3a 3′-UTR荧光素酶活性(P<0.01),但对其突变型荧光素酶活性无影响(P>0.05)。Dkk1预处理几乎完全逆转miR-27a-3p抑制物对ColⅠ、ColⅢ合成的诱导作用(P<0.05)。结论 miR-27a-3p抑制肺成纤维细胞ColⅠ、ColⅢ生物合成,其机制与拮抗Wnt3a/β-catenin信号通路有关。

特拉唑嗪联合抗生素治疗Ⅲ型前列腺炎疗效观察

目的:探讨盐酸特拉唑嗪联合抗生素治疗Ⅲ型前列腺炎的临床效果。方法:将86例Ⅲ型前列腺炎患者随机分为观察组和对照组,分别给予盐酸特拉唑嗪(2 m g,每晚1次)+左氧氟沙星(200 m g,2次/d)和左氧氟沙星(200 m g,2次/d)治疗,8周后观察慢性前列腺炎症状指数(N IH-CPS I)评分及前列腺液(EPS)常规。结果:经过8周的治疗,观察组和对照组的N IH-CPS I评分、EPS常规中白细胞数目均有显著下降,但观察组下降的程度均较对照组明显。结论:盐酸特拉唑嗪联合左氧氟沙星治疗Ⅲ型前列腺炎比单用左氧氟沙星疗效明显,值得临床推广。

知母皂苷A-Ⅲ、知母皂苷C对照品的制备与鉴定

目的:研究知母中知母皂苷A-Ⅲ、知母皂苷C对照品的制备方法,并对其进行鉴定。方法:采用大孔吸附树脂、硅胶色谱、Sephadex LH-20色谱、反相ODS色谱分离制备对照品,采用红外、质谱、核磁等波谱方法进行结构鉴定。结果:从知母中分离得到知母皂苷A-Ⅲ与知母皂苷C对照品,纯度均>98%。结论:本试验结果可为知母皂苷的新药开发提供物质基础。

1例暴发性心肌炎患者的救护

患者,女,27岁。因发热、胸闷、心悸5 d,加重7 h,以＂重症心肌炎、心功能Ⅳ级、Ⅲ度房室传导阻滞＂于2009-12-24收入笔者所在科。查体：体温36.5℃,脉搏52次/min,呼吸25次/min,血压140/70 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）。意识清楚,急性病容,端坐呼吸。心电图示：三度AVB,室性逸博心率;X线胸片示：右下肺炎性改变;心肌酶谱示：乳酸脱氢酶519 U/L,肌酸激霉670 U/L,肌酸激酶同工酶102 U/L,谷草转氨酶267 U/L,a-羟丁酸脱氢酶640 U/L;

PD-1抑制剂联合化疗一线治疗ⅢA-ⅣB食管癌25例报道

探讨PD-1抑制剂联合化疗一线治疗ⅢA-ⅣB食管癌疗效及安全性。方法:回顾性分析重庆医科大学附属第三医院胸外科初治ⅢA-ⅣB食管癌及食管胃结合部腺癌患者共25例,使用帕博利珠单抗/信迪利单抗联合白蛋白紫杉醇±顺铂/卡铂联合治疗,观察患者进食梗阻情况、影像学缓解率、不良反应以及6月生存率、12月生存率。结果:随访时间6-26月;其中92.00%患者进食梗阻缓解;缓解程度为72%为完全缓解,28%为部分缓解。15例出现影像学上肿瘤退缩,影像学缓解率60.00%,32%影像学提示肿瘤为稳定状态,8%例为影像学进展。患者6月OS率为96.00%;12月OS率为:71.43%。不良反应方面:总体发生率为88.00%;80%出现消化道不良反应,50%患者联合治疗后出现骨髓抑制,程度为一度至三度;出现内分泌毒性反应6例,5例甲状腺功能减退,1例甲状腺功能亢进,且均为1-2级不良反应;4例出现免疫相关肝损害,程度为一级;20%患者出现免疫相关性皮肤损害;未出现免疫相关肺炎、肾毒性以及心肌毒性反应。结论:PD-1抑制剂联合化疗治疗初治不可手术食管癌具有较好的抗肿瘤效果,不良反应较轻可控。

知母皂苷AⅢ抗血栓作用研究

目的:确定知母皂苷AⅢ体内、外给药对大鼠血小板聚集和血栓形成的抑制作用。方法:比浊法测定血小板聚集,动-静脉旁路血栓模型测定大鼠在体血栓的形成。结果与结论:体外血小板聚集模型研究证明,知母皂苷AⅢ可以抑制由ADP、胶原和凝血酶诱导的大鼠血小板的聚集,并呈剂量效应。体内给药同样可以有效抑制血小板的聚集率,当给药剂量达到40 mg/kg.d-1时对血小板聚集的抑制率可以达到26.7%。动-静脉旁路血栓形成实验结果显示,知母皂苷AⅢ体内给药可减小血栓的湿重和干重,说明知母皂苷AⅢ体内给药具有抗血栓的作用。知母皂苷AⅢ体内给药不影响出凝血时间。推测其抗血栓形成的功效可能是通过抑制血小板的黏附、聚集和活化而实现的。

知母皂苷AⅢ抑制人脑胶质瘤增殖生长的机制研究

考察知母皂苷AⅢ抑制人脑胶质瘤U87MG细胞增殖的作用及机制分析。在裸鼠皮下荷瘤模型中,知母皂苷AⅢ组与模型组相比,显著降低瘤重。知母皂苷AⅢ呈剂量依赖性抑制U87MG细胞的体外增殖;呈剂量依赖性降低β-Catenin,Cyclin D1,Bcl-2的蛋白表达,同时升高p21在蛋白和基因水平的表达;降低ERK磷酸化水平,抑制β-Catenin的核转移,同时提高p38和JNK蛋白的磷酸化水平。联用JNK抑制剂SP600125和p38抑制剂SB203580后可逆转知母皂苷AⅢ处理而提高的p21和降低的β-Catenin的蛋白表达。知母皂苷AⅢ部分通过干预MAPK及Wnt/β-Catenin信号通路而抑制脑胶质瘤U87MG的增殖。

湖南汉族系统性红斑狼疮患者FcγRⅢa—158V/F多态性研究

目的探讨中国湖南汉族SLE患者与FcγRⅢa—158V/F多态性的相关性。方法SLE患者65例,其中狼疮肾炎患者38例,采用多聚酶链反应(PCR)和限制性片段长度多态性分析法(RFLP)检测FcγRⅢa—158V/F基因型,并与60例正常人进行比较。结果①与对照组相比,SLE患者FcγRⅢa—158F/F纯合子基因型显著增高(OR=2.23,χ2=4.69,P=0.03)。②与对照组相比,狼疮肾炎患者Fc-γRⅢa—158F/F纯合子基因型和FcγRⅢa—158F等位基因频率均显著增高(OR=2.67,χ2=5.36,P=0.02;OR=2.00,χ2=4.91,P=0.03)。结论SLE患者FcγRⅢa—158F/F纯合子基因型显著增高,狼疮肾炎患者FcγRⅢa—158F/F纯合子基因型和FcγRⅢa—158F等位基因频率均显著增高,提示FcγRⅢa多态性与SLE相关,FcγRⅢa—158F等位基因可能是狼疮肾炎的危险因素。

载脂蛋白AⅠ-CⅢ基因簇多态性在心脑血管疾病低发的云南德宏傣族中的分布情况

目的探讨载脂蛋白(apolipoprotein,apo)AⅠ-CⅢ基因簇的apoAⅠ/MspⅠ和apoCⅢ/SstⅠ基因多态性在心脑血管疾病低发的云南德宏傣族人群中的分布情况。方法2002年4～5月在云南德宏和昆明两地随机抽样168名傣族和72名汉族人,提取基因组DNA后,应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-restriction fragment length polym orphism,PCR-RFLP)技术检测apoAⅠ-CⅢ基因簇中apoAⅠ启动子区MspⅠ多态性(-75bpG/A和+83bpC/T)和apoCⅢ3′端非编码区的SstⅠ多态性。结果apoAⅠ-CⅢ基因簇的apoAⅠ/MspⅠ和apoCⅢ/SstⅠ的等位基因M1+、M1-、M2+、M2-、S+、S-在傣汉两民族的分布频率依次为傣族:0.735、0.265、0.938、0.062、0.310、0.690;汉族:0.715、0.285、0.917、0.083、0.347、0.653。apoAⅠ-CⅢ基因簇的这6个等位基因频率在傣汉两民族间无统计学意义(P>0.05)。比较分析21个不同人群apoAⅠ/MspⅠ基因多态性和35个不同人群apoCⅢ/SstⅠ基因多态性的结果表明,德宏傣族人群apoAⅠ-CⅢ基因簇多态性分布与同属于蒙古人种的人群接近,而与高加索人种和尼格罗人种有较大的差异性。结论apoAⅠ-CⅢ基因簇的apoAⅠ基因启动子区-75bp和+83bp位点的基因多态性可能是德宏傣族人群心脑血管疾病患病率较低的重要遗传因素。而apoCⅢ的S+等位基因在该人群中并不是心脑血管疾病患病的易感因子。傣族人群具有较低的心脑血管疾病患病率应归因于遗传因素和环境因素协同作用的结果。

知母皂苷AⅢ对黑色素瘤B16细胞生长和Bax,Bcl-2 mRNA的影响

目的观察知母皂苷AⅢ对体外培养黑色素瘤B16细胞增殖和凋亡的影响。方法体外培养B16细胞,分别以浓度为1,2,4,8,16μmol·L-1的知母皂苷AⅢ作用24 h,通过MTT比色法检测对细胞生长的影响;倒置显微镜观察对细胞形态的影响;Annexin V-FITC/PI双染流式检测对细胞凋亡的影响;逆转录PCR检测对细胞凋亡相关基因Bax,Bcl-2的影响。结果 8,16μmol·L-1的知母皂苷AⅢ明显抑制细胞增殖,24 h的半数抑制浓度(IC50)为10.16μmol·L-1;细胞形态显示16μmol·L-1的知母皂苷AⅢ使细胞体积缩小变圆,细胞减少。与对照组比较,10μmol·L-1知母皂苷AⅢ细胞凋亡率为(4.83±0.25)%(P<0.01),而Bax/Bcl-2比值升高(P<0.05)。结论体外实验显示知母皂苷AⅢ能明显抑制B16细胞生长,并能诱导部分细胞发生凋亡。由于诱导细胞凋亡率与24 h的IC50有一定差距,因此知母皂苷AⅢ对B16细胞生长的影响可能不仅仅与激活凋亡信号通路有关,还与其他细胞生长信号通路有关。

知母皂苷AⅢ调控代谢抗脑胶质瘤生长的机制研究

该研究利用非靶向代谢组学技术考察知母皂苷AⅢ(timosaponin AⅢ, TIA)干预脑胶质瘤原位荷瘤小鼠血清中的代谢物变化,探究脑胶质瘤颅内生长及TIA干预的代谢相关机制。小鼠随机分为空白组、脑胶质瘤原位荷瘤模型组及TIA组。HPLC-LTQ-Orbitrap Elite液质联用检测以上3组小鼠处理4周后各组小鼠血清中的代谢产物变化,对检测到的代谢物进行主成分分析(principal component analysis, PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA)后,根据变量重要性投影(variable important in projection, VIP)和P(P<0.05)遴选差异代谢物。结果显示,TIA显著抑制脑胶质瘤的体内生长,对体质量影响不大。血清样本组间可明显区分,与空白组相比,模型组中神经酰胺、琥珀酸、α-酮戊二酸、柠檬酸、硫酸吲哚酚、3a, 6b, 7b-三羟基-5b-胆酸共6个差异代谢物的水平均降低。与模型组相比,TIA组中5种差异代谢物,除苯酚硫酸盐含量降低之外,PC[20:4(5Z,7E,11Z,14Z)-OH(9)/DiMe(9,3)]、邻棕榈酰肉碱、α-酮戊二酸、柠檬酸的水平均显著提高。通过MetaboAnalyst进行通路分析,以上差异代谢物富集于三羧酸循环,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径。结果表明,脑胶质瘤在颅内生长过程中α-酮戊二酸、柠檬酸等代谢物水平降低,TIA通过调控三羧酸循环,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径,提高α-酮戊二酸、柠檬酸等代谢产物水平,发挥抗脑胶质瘤颅内生长的作用。

比色法测定大蒜提取物中大蒜总皂苷含量

目的:建立一种大蒜提取物中总皂苷含量的测定方法。方法:以知母皂苷A-Ⅲ为对照品,香草醛-高氯酸比色法测定大蒜提取物中总皂苷含量。结果:知母皂苷A-Ⅲ在20.16～181.44μg与吸光度呈良好线性关系,回归方程为Y=4.839X+0.066,r=0.999 5(n=9),平均回收率100.6%,RSD 1.5%。结论:该方法简单,准确性、重复性良好,可作为大蒜提取物中总皂苷质量控制方法。

树脂分离光度法测定金、钯、铂

用Amberlyst A-26大孔阴离子交换树脂分离金(Ⅲ)、铂(Ⅳ)和钯(Ⅱ)。在HAc-NaAc缓冲液中,用易溶于水的显色剂N-烯丙基-N'-(对氨基苯磺酸钠)硫脲(ASATu)和N-间甲苯基-N'-(对氨基苯磺酸钠)硫脲(MMPT)测定。前者测定金(Ⅲ),后者同时测定铂(Ⅳ)和钯(Ⅱ)。该法用于催化剂和阳极泥样品的测定,结果满意。其相对标准偏差(RSD)小于2.4%,回收率在96.0%～98.2%。铂(Ⅳ)和钯(Ⅱ)不需要予先分离可同时测定。