花鲈肠上皮细胞原代培养及鉴定方法的探讨研究

为探究建立稳定可靠的花鲈肠上皮细胞原代培养方法,通过组织块法和酶消化法培养花鲈肠上皮细胞,确定酶消化法的最佳消化液及消化时间,所得细胞悬液于L-15培养液中进行培养。利用形态学观察、透射电镜观察和碱性磷酸酶染色方法对细胞进行鉴定。结果显示:组织块法细胞迁出情况不稳定,且迁出时间较长;酶消化法的最佳消化液为胶原酶Ⅰ、Ⅳ联合消化液,最佳消化时间为45 min;胶原酶Ⅰ、Ⅳ联合消化法获得的细胞连接紧密、排列整齐、呈上皮细胞典型的“铺路石”状,细胞相对独立、界限清晰。透射电镜观察和碱性磷酸酶染色进一步证实所培养的细胞为肠上皮细胞。总之,经胶原酶Ⅰ、Ⅳ联合消化液消化45 min、培养48 h可得到初始条件一致、生长旺盛的花鲈原代肠上皮细胞。

大鼠骨髓单个核细胞诱导扩增为内皮祖细胞的细胞分离方法、接种数目、培养瓶包被条件

目的筛选大鼠骨髓单个核细胞(BMMNCs)诱导扩增为内皮祖细胞(BM-EPCs)的细胞分离方法、接种数目、培养瓶包被条件,构建一个高效、高产量、高纯度的骨髓来源BM-EPCs分离培养诱导扩增方法。方法取2周龄雄性SD大鼠,脱颈处死后分离大鼠双侧胫骨和股骨,收集骨髓细胞悬液。配制30%、50%、60%和70%浓度的Percoll细胞分离液,通过Percoll密度梯度离心法分离出大鼠BMMNCs种子细胞,并计算活细胞比例。将获得的BMMNCs分为1×10^(5)、5×10^(5)、1×10^(6)、2.5×10^(6)、5×10^(6)、1×10^(7)六个组别,分别接种于25 cm^(2)无菌培养瓶中,培养7 d后镜下观察各组细胞集落形成数目,并计算每10^(6)细胞的集落形成数。运用Graphpad prism9.5软件进行Logistic拟合曲线,根据相关系数R^(2)确定相关性,根据其P值将有统计学差异的接种数目纳入范围,随后使用R语言编程定义计算函数,根据已知种子细胞总数及相关性函数限制下,通过迭代寻找最佳的BMMNCs细胞接种数目。分别配制20、50、100 nmol/L浓度的人纤连蛋白(FN)溶液,以不添加FN的空白溶液为对照,分别包被空白培养瓶2、6、12、24 h,将收集的48 h未贴壁BMMNCs接种于FN包被的各培养瓶中,静置培养3 d后计算各组集落形成数目,确定FN包被的最佳浓度与时间。接种48 h未贴壁BMMNCs于25 cm^(2)培养瓶底,使用EGM-2完全培养基定向诱导,于显微镜下观察集落形成及诱导扩增进程。取培养14 d的BM-EPCs,分别采用双阳性染色法和流式细胞术鉴定BM-EPCs的纯度。结果使用Percoll分离法可把BMMNCs细胞清晰的分为5层,其中30%与50%Percoll细胞分离层之间为BMMNCs活细胞比率最高。BMMNCs的最优接种数目为2.5×10^(6)个。以50 nmol/L的FN溶液包被24 h或以100 nmol/L的FN溶液包被6 h皆可有效促进细胞集落形成。细胞接种7 d后获得形态良好的铺路石样细胞并建立生长优势,表明BMMNCs已经诱导成为形态良好的BM-EPCs。Dil-Ac-LDL/FITC-UEA-1双阳性细胞占比为91.89%±5.77%,CD31+KDR阳性率为90.73%±0.61%、CD14阳性率为0.53%±0.17%、CD45阳性率0.77%±0.34%,说明获得的BM-EPCs纯度良好。结论大鼠BMMNCs诱导扩增为BM-EPCs过程中,可使用Percoll密度梯度离心法分离BMMNCs,BMMNCs的最优细胞接种数目为2.5×10^(6)个,细胞培养瓶包被条件为以50 nmol/L的FN溶液包被24 h或以100 nmol/L的FN溶液包被6 h,分离培养诱导获得的BM-EPCs形态和纯度均良好。

改良酶消化法体外培养、纯化分离人颞下颌关节滑膜A型细胞

目的探讨获取人颞下颌关节滑膜A型细胞的较佳方法,为A型细胞的进一步研究奠定基础。方法分别用组织块法、传统酶消化法与改良的酶消化法培养滑膜细胞,观察培养3 d、7 d、2周、4周时细胞生长情况,记录首次传代时间。通过免疫组化检测衬里层细胞CD68、组织蛋白酶S的表达来检测A型细胞吞噬功能。结果滑膜组织块法接种约7 d后部分组织块周围有细胞游离出来,约4周后滑膜细胞长势接近80%融合密度,可进行首次细胞传代。传统酶消化法细胞贴壁缓慢,4周时才能观察部分细胞团形成,向周围呈放射状生长,约6周后才可首次传代。改良酶消化法接种3 d后,光镜下观察部分单个细胞贴壁,有一些胶原酶未消化完全而又能经过研磨透过滤网的微小组织块或细胞团块,在贴壁后迅速向周围增殖,约2周后可首次传代,3周后再次传代的细胞量与组织块法4周后首次细胞传代时间相同。免疫组化检测CD68有阳性表达,细胞位于靠近关节腔侧,组织蛋白酶S未见阳性表达。结论改良的酶消化法培养对比组织块法、传统酶消化法,在获得相同细胞量的基础上,缩短了原代细胞培养时间。改良酶消化法传代时A型细胞尚在存活期间,给后期A型细胞纯化分离奠定了基础。巨噬细胞标志物Cathepsin S在A型细胞上无表达,提示A型细胞由于体内局部环境的作用,已有别于巨噬细胞。

兔角膜缘上皮细胞体外培养及其生物学特性的初步研究

目的 :建立体外培养兔角膜缘上皮细胞的方法 ,观察其体外生长的生物学特性。方法 :应用组织培养的方法 ,对兔角膜缘上皮细胞进行体外原代和传代培养。用倒置显微镜观察培养的兔角膜缘上皮细胞体外生长的特征。用苏木精 -伊红染色、糖原( PAS)染色、细胞角蛋白免疫组化染色和电镜检查的方法对培养细胞进行形态学检查和鉴定。结果 :兔角膜缘上皮细胞可以在体外成功的培养传代。原代培养细胞大多 4 8h贴壁 ,5天后旺盛生长 ,15天形成单层。传代培养细胞次日贴壁 10天形成单层。细胞角蛋白 AE1单克隆抗体染色阳性 ,PAS染色阴性。培养细胞呈多角形 ,细胞表面具有丰富的微绒毛 ,细胞之间有桥粒连接。结论 :应用组织培养的方法可以成功获得原代和传代培养的兔角膜缘上皮细胞 ,培养的细胞具有与正常兔角膜上皮细胞相一致的生物学特性。

兔骨髓间充质干细胞的生物学特征及原代培养

背景:兔来源的骨髓间充质干细胞是具有较强的体外增殖和多系统分化潜能的成体干细胞,在组织工程及生物治疗领域蕴藏着巨大的潜能。目的:体外培养扩增、鉴定兔骨髓间充质干细胞,观察骨髓间充质干细胞的生物学特征。方法:无菌条件下抽取兔骨髓,分别运用全骨髓贴壁法和Percoll密度梯度离心法体外分离骨髓间充质干细胞,利用差速贴壁原理对细胞进行纯化扩增。在显微镜下观察细胞形态特征及生长规律,流式细胞技术检测细胞表面抗原标记物的表达。结果与结论:兔骨髓间充质干细胞贴壁时间短,增殖快,经过细胞传代后能够获得进一步纯化的细胞,杂质细胞减少。原代细胞形态即呈现三角形、长梭形、纺锤形的贴壁细胞特征。第5代骨髓间充质干细胞呈典型的极性漩涡状生长,形态单一均匀,不具有表达造血前体细胞表面标志抗原CD34和白细胞表面标志抗原CD45的表面标记物功能,但是具有能够表达出整合素家族的成员CD29及黏附分子CD44的特点。说明经全骨髓贴壁法和Percoll密度梯度离心法体体外分离培养的细胞在形态学、细胞表面标志物表达和多向分化能力方面具有干细胞生物学特性,经流式细胞分析鉴定为兔骨髓间充质干细胞。

人髌下脂肪垫来源脂肪间充质干细胞的分离、培养及鉴定

背景:髌下脂肪垫在膝关节手术中经常要部分切除,其可以作为脂肪间充质干细胞的重要来源。目的:探讨自髌下脂肪垫中分离、培养脂肪间充质干细胞的策略及细胞分子表面标记情况。方法:髌下脂肪垫组织取自膝关节镜手术的患者,以Ⅰ型胶原酶消化消化脂肪组织获取干细胞,用10%低糖DMEM培养基培养,利用MTT法测定不同代细胞增殖情况并绘制生长曲线。检测第5代细胞表面CD29及CD44的表达。结果与结论:培养24 h后可见原代细胞贴壁,1周后细胞呈纺锤型并且增殖速度加快,传代后的细胞贴壁及增殖细胞速度加快。生长曲线示第2及第5代的细胞增殖能力明显较第8代能力强。所取细胞能够分化为骨细胞和脂肪细胞。流式细胞仪检测结果显示第5代脂肪间充质干细胞重96.8%表达CD29,97.6%表达CD44。提示自髌下脂肪垫分离及提取脂肪干细胞简单易行,所得细胞的纯度及增殖能力均符合组织工程种子细胞的基本条件。

原代人脂肪基质细胞体内成骨能力的检测

目的:检测原代人脂肪基质细胞(human adipose-derived stromal sells,hASCs)的体内成骨能力,为应用其构建组织工程化骨奠定基础。方法:酶消化法分离原代hASCs,细胞经成骨向和成脂肪向诱导后,碱性磷酸酶(al-kaline phosphatase,ALP)染色和茜素红矿化染色检测其成骨向分化的能力,油红O染色检测其成脂肪向分化的能力。体内实验使用12只裸鼠,于其背部一侧皮下植入原代hASCs+支架材料作为实验组,同一裸鼠的另一侧植入单纯支架材料作为对照组。植入4周和8周后取材,制成组织切片,进行HE染色和免疫组织化学染色观察。结果:300 mL脂肪组织中可以获得约6×107个原代hASCs。体外实验证实原代hASCs具有成骨向和成脂肪向分化的潜能。HE染色可见,植入4周和8周后植入物中有类骨组织形成,免疫组织化学染色显示骨钙素、ALP和抗人核抗体呈阳性表达。结论:原代人脂肪基质细胞与支架材料构建的复合物可以在裸鼠体内成骨。

红掌研究综述

红掌（ＡｎｔｈｕｒｉｕｍａｎｄｒａｅａｎｕｍＬｉｎｄ．）是世界名贵花卉，其花独特，佛焰苞艳丽，瓶插寿命长，作为切花栽培有很高的经济价值，国内外研究在组织培养方面的报道较多．本文介绍该名花及综述了１０年来的研究概况．

4种小鼠肠上皮细胞分离培养方法的比较

【目的】比较4种小鼠肠黏膜上皮细胞(Intestinal epithelial cells,IECs)分离方法的分离效果,建立小鼠IECs的有效分离培养方法,获得小鼠IECs原代细胞,为后续研究做准备。【方法】分别采用组织块培养法、嗜热菌蛋白酶消化法、胶原酶Ⅺ和中性蛋白酶Ⅰ联合消化法以及胶原酶Ⅰ和中性蛋白酶Ⅵ联合消化法共4种方法分离小鼠IECs并培养,通过细胞免疫组织化学法和细胞免疫荧光法对分离的IECs进行细胞特异性鉴定,比较4种方法的分离效果。【结果】组织块培养法所获IECs活力好,增殖能力强,但成纤维细胞污染较严重,细胞纯度低;胶原酶Ⅰ和中性蛋白酶Ⅵ分离法获得的IECs数量少且细胞增殖能力弱;嗜热菌蛋白酶消化法及胶原酶Ⅺ与中性蛋白酶Ⅰ联合消化法所获得的小鼠IECs纯度较高,原代培养时增殖能力稍弱于组织块培养法,但传代后增殖能力趋于稳定。通过细胞免疫组织化学法和细胞免疫荧光法对分离的细胞进行鉴定,结果表明,分离的细胞多数为小鼠IECs。【结论】嗜热菌蛋白酶消化法及胶原酶Ⅺ与中性蛋白酶Ⅰ联合消化法均适合肠道上皮细胞的分离和培养。

显微剥离酶消化法体外培养人胚胎食管鳞状上皮细胞的方法研究

目的探讨利用显微剥离酶消化法行人胚胎食管鳞状上皮细胞原代培养的可行性,并对所得细胞进行纯化及传代培养。方法选择意外流产20周龄胎儿食管标本,通过显微剥离法获得菲薄食管黏膜上皮,经短时酶消化分离所得细胞,在10%胎牛血清混合培养基中培养,通过倒置显微镜、透射电镜及免疫组织化学方法鉴定所得细胞,并测定其生长曲线。结果倒置显微镜下见细胞呈不规则圆形或多边形,透射电镜可见其具有鳞状上皮细胞特征性的张力微丝,细胞表面微突起,细胞角蛋白免疫组织化学染色胞浆呈棕黄色阳性表现,MTT法测定第2代细胞在传代培养3~4d达生长高峰。3、4d吸光度(A)值与1、2、5及6d比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论通过显微剥离酶消化法可获得足量、较纯食管鳞状上皮细胞,混合培养基中细胞能快速传代、扩增,适宜作为种子细胞构建组织工程食管。

低氧对脂肪干细胞和关节软骨细胞三维共培养成软骨能力的影响

背景:多项体内外研究表明低氧和共培养均促进干细胞向软骨细胞方向分化。目的:观察低氧对脂肪干细胞和关节软骨细胞三维共培养成软骨能力的影响。方法:脂肪干细胞和关节软骨细胞二者按3∶1比例混合,以5×1010 L-1接种于聚乳酸-羟基乙酸共聚物/明胶支架上,分别在常氧(体积分数为20%O2)、低氧(体积分数为5%O2)环境下培养6周。苏木精-伊红染色进行组织学分析,阿尔新蓝染色鉴定糖胺多糖的合成,免疫组化鉴定Ⅱ型胶原的表达,并测定各组支架-细胞复合物的DNA、糖胺聚糖、羟脯氨酸含量。结果与结论:低氧组苏木精-伊红染色显示大量细胞及细胞外基质生成,阿尔新蓝染色显示有大量糖胺多糖生成,免疫组化显示Ⅱ型胶原表达强阳性,且DNA、糖胺聚糖、羟脯氨酸等各项指标均高于常氧组。表明低氧促进脂肪干细胞和关节软骨细胞共培养成软骨分化。

酶消化法和组织块法培养心肌干细胞的比较

背景:目前国内动物研究中提取心肌干细胞方法不统一,分离培养及提纯未形成规范化的流程。目的:探讨酶消化法和组织块法培养大鼠心肌干细胞的差异。方法:取清洁级1 d龄SD大鼠心脏组织,分为组织块组与酶消化组,分别使用酶消化法和组织块法体外培养心肌干细胞。结果与结论:酶消化法和组织块法均能培养出心肌干细胞,但组织块组培养的细胞中心肌干细胞比例显著高于酶消化组。提示在心肌干细胞培养过程中,组织块法优于酶消化法。

胰蛋白酶消化法和组织块法原代培养人包皮成纤维细胞的比较

小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)是目前国际上公认的人胚胎干细胞(hESCs)体外培养的饲养层细胞,但MEFs存在寿命短、动物源性污染等问题,需要探索适于hESCs体外培养且寿命长的人源性饲养层.采用胰蛋白酶消化法和组织块法分别原代培养人包皮成纤维细胞(hFFs),探索hFFs原代培养的最佳方法,为hFFs作为饲养层在hESCs研究中的应用提供可靠的科学依据;通过倒置显微镜下观察其生长状态和免疫细胞化学染色鉴定,结果显示两种原代培养方法获得的hFFs的形态及生物学特性均符合成纤维细胞;通过测定细胞生长曲线及MTT法检测,结果显示两种原代培养方法获得的不同代数的hFFs均具有较高的增殖活性,传代10余代仍能保持较好的细胞形态,可以制备成饲养层用于hESCs的研究.

玉米3种非组培转基因方法转化外源bar基因研究

本试验用3种非组培型转基因方法,即花粉介导、子房注射、萌动种胚法在玉米上转化bar基因,经大田筛选及PCR和PCRSouthern检测,证明均可获得转化植株。还分析了3种方法的转化机理,并通过转化率与操作简便程度的比较,认为花粉介导优于萌动种胚法,二者又优于子房注射法。

无血清悬浮法培养MCF-7细胞系并筛选该细胞系中肿瘤干细胞相关亚群的初步研究

目的:研究无血清培养基悬浮培养MCF-7乳腺癌细胞系,筛选并鉴定MCF-7乳腺癌细胞系中的肿瘤干细胞相关亚群。方法:应用乳腺癌培养基在无血清的条件下悬浮培养MCF-7乳腺癌细胞系。通过无血清培养筛选乳腺癌细胞系肿瘤干细胞相关亚群,将其接种于含血清培养基,观察分化。应用单克隆形成实验、表面标志检测、HOECHST33342染色检测来确定培养出的细胞中肿瘤干细胞的比例及其培养后肿瘤干细胞含量的变化。结果:乳腺癌MCF-7细胞系中有约2.12%的肿瘤细胞在无血清培养基中能够存活、增殖,形成自由漂浮的细胞球。细胞球可连续传代,若重新接种于含血清培养基中可重新贴壁分化,贴壁分化后细胞形态与直接在含血清培养基中培养的MCF-7无明显差别。流式细胞仪表面标志检测,细胞球中约含83.13%表达CD24-CD44+的细胞,HOECHST33342染色提示细胞球中约含10.06%的侧亚群(sidepopulation)细胞。结论:MCF-7细胞系可在含生长因子的无血清培养基中悬浮生长,并维持细胞系。该细胞系中含有比例较低的具有增殖和分化能力的乳腺癌干细胞相关亚群。表面标志以及HOECHST33342检测差异提示细胞球中仅约1/8细胞具有干细胞的功能。

人涎腺上皮细胞体外培养及其生物学特性的初步研究

目的建立体外培养人涎腺上皮细胞的方法,观察其体外生长的生物学特性。方法应用组织块培养法,用无血清培养基(SFM),无血清1∶1DMEM/F12以及含25ml/L胎牛血清的1∶1DMEM/F123种不同的培养基对10例人涎腺标本进行体外原代和传代培养。用倒置显微镜观察培养细胞体外生长的形态特征。用细胞计数法观察细胞生长情况。用HE染色、PAS染色、细胞角蛋白、Vimentin免疫组化染色对培养细胞进行形态学检查和鉴定。结果10例人涎腺标本在体外原代培养均有细胞长出,培养的细胞为上皮样。用SFM培养的细胞增殖较旺盛,可传代培养5次,用其它2种培养基培养的细胞仅可传代1次。细胞角蛋白染色阳性,Vi-mentin染色阴性,PAS染色阳性。结论应用组织块培养的方法可以获得原代和传代培养的人涎腺上皮细胞,SFM较1∶1DMEM/F12更适宜涎腺上皮细胞生长。

全骨髓贴壁法培养兔骨髓间充质干细胞体外定向成骨诱导分化及鉴定

背景:流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法对细胞活性影响较大,密度梯度离心法虽然能够获得纯度高的单核细胞,但由于多次离心可造成细胞的大量流失且对细胞活性有一定的影响使其应用值得商榷。目的:采用全骨髓贴壁法分离兔骨髓间充质干细胞进行成骨诱导分化及鉴定。方法:采用全骨髓贴壁法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞,倒置显微镜下观察细胞形态学特征。在成骨诱导剂作用下,通过碱性磷酸酶染色试剂盒行碱性磷酸酶染色,Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色,VonKossa法及茜素红进行矿化结节染色以及电镜下检测兔骨髓间充质干细胞成骨诱导后的形态结构。结果与结论:经诱导后细胞出现与成骨细胞相似的形态学特征,碱性磷酸酶染色阳性,Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色,Von-Kossa法及茜素红矿化结节染色阳性。表明经成骨诱导剂诱导后全骨髓贴壁法体外分离纯化培养的兔骨髓间充质干细胞能向成骨细胞方向分化增殖。

绒山羊附睾上皮细胞培养方法的建立及其生长特性

本研究旨在建立一种简单易行、获取细胞纯度高的绒山羊附睾上皮细胞体外培养体系。10~12月龄绒山羊附睾头部分别采用酶消化法和改良组织块消化法进行原代培养,利用免疫细胞化学染色法和免疫荧光化学法对细胞进行鉴定,同时利用流式细胞仪和CCK法分别检测细胞纯度和增殖情况,在电镜下观察细胞超微结构。结果表明,两种培养方法所获的细胞均呈岛屿状克隆生长和较好的增殖能力,具有活跃的分泌和代谢功能;上皮细胞特异性的角蛋白18和附睾特异性的谷胱甘肽过氧化物酶5(GPx5)的表达以及流式细胞仪结果显示,两种方法所获细胞均为纯度较高的附睾上皮细胞,但改良组织块消化法获得原代细胞需要的时间长,酶消化法获得原代细胞时间短,获得的细胞量大。本研究结果为进一步研究绒山羊附睾上皮功能提供了良好的基础。

不同年龄供体人牙周膜细胞原代培养成功率的比较

目的:通过研究供体年龄对组织块法原代培养人牙周膜细胞的影响,寻找人牙周膜细胞原代培养的最佳供体年龄,为便捷、快速地获得大量人牙周膜细胞提供理论依据。方法:将在口腔外科门诊收集正畸拔除的12～28岁青少年健康前磨牙68颗,按供体年龄分为3组:12～14岁组、15～18岁组和19～28岁组,采用组织块法原代培养人牙周膜细胞并传代,通过形态学和免疫化学染色方法对其进行鉴定。结果:不同年龄组牙周膜经组织块法原代培养获得的人牙周膜细胞的成功率不同,12～14岁组最高,成功率为66.67%;15～18岁组次之,成功率为8.57%;19～28岁组最低,成功率为0。12～14岁和15～18岁组传至第3代细胞免疫组织化学检测显示细胞波形丝蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性,表明为中胚层组织来源。结论:供体年龄对体外原代培养人牙周膜细胞成功率有很大影响,12～14岁为最佳供体年龄。

改良组织块法体外培养人牙周膜细胞和牙髓细胞

目的:探索一种操作简单方便的人牙周膜细胞和牙髓细胞体外培养方法。方法:取12个正常恒牙牙周膜组织和28个正常恒牙牙髓组织,剪碎组织,将细胞培养专用圆形盖玻片覆盖在组织块上,用凡士林将盖玻片固定在培养皿底壁,然后加入培养液培养,待组织块周围细胞生长密集时,进行原位传代。用免疫细胞化学染色的方法鉴定牙周膜细胞的来源,RT-PCR检测牙髓细胞中牙本质涎磷蛋白基因的表达。结果:在改良组织块法中未发现有漂浮的组织块,可获得牙周膜细胞和牙髓细胞,成功率分别是91.7%和76%。获得的牙周膜细胞和牙髓细胞符合各自的形态学特征和生物学特性,生长良好。结论:本实验建立的改良组织块法解决了传统组织块法中组织块难以贴壁的问题,简化了操作步骤并具有较高的成功率,是一种培养牙周膜和牙髓细胞的可行方法。