副溶血弧菌tlh基因的克隆、表达及功能的研究

目的 构建融合表达载体pET32a+-tlh ,获得具有生物活性功能的蛋白。方法 用PCR法扩增tlh全序列 ,克隆入 pET32a +高效表达载体进行诱导表达 ,亲和层析纯化目的蛋白 ,采用逐步透析的复性方法 ,并对复性产物进行功能检测。结果与结论 成功构建了融合表达载体pET32a +-tlh ,在大肠杆菌DE3 中表达产物以包涵体形式存在 ,复性后的蛋白在卵磷脂存在下具有溶血活性。

副溶血弧菌tlh基因的克隆及序列分析

目的 构建副溶血弧菌不耐热性溶血毒素 (thermolabilehemolysin ,TLH)tlh基因重组质粒。方法 根据已知GenBank中的tlh基因序列 ,设计合成一对引物 ,用PCR方法从副溶血弧菌基因组DNA中扩增编码TLH的基因片段 ,克隆至pET32a+ 质粒 ,转化大肠杆菌DH5感受态细胞 ,经酶切及PCR鉴定 ,而后进行测序。结果 tlh基因体外扩增产物大小约1 30 0bp ,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子 ,测序结果与已知序列基本吻合。 结论 在国内首次克隆了副溶血弧菌tlh基因 。

VHH/TLH溶血素基因在海洋弧菌中分布的研究(英文)

哈维氏弧菌（V.harveyi）的VHH溶血素是对海水养殖鱼类的潜在致病因子。哈维氏弧菌的VHH溶血素基因与副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）的TLH热不稳定性溶血素基因具有高度相似性,其氨基酸序列的相似性达到85.6 %。根据哈维氏弧菌vhhA溶血素基因序列,合成一个地高辛标记的VHH基因探针,利用其进行Southern Blot ,检测VHH溶血素基因在57株弧菌（包括26株国际标准菌株,20株哈维氏弧菌,11株副溶血弧菌）中的分布情况。结果显示,VHH基因探针与13株弧菌标准菌株有强杂交信号,包括2株溶藻胶弧菌（V.alginolyticus） ,2株哈维氏弧菌以及1株霍氏格里蒙菌（Grimontia hollisae） ,坎贝氏弧菌（V.campbellii） ,辛辛那提弧菌（V.cincinatiensis） ,费氏弧菌（V.fischeri） ,拟态弧菌（V.mimicus） ,飘浮弧菌（V.natriegens） ,副溶血弧菌,解蛋白弧菌（V.proteolyticus）和火神弧菌（V.logei）。与6株弧菌标准菌株有弱杂交信号,包括鳗弧菌（V.anguillarum） ,河口弧菌（V.aestuarianus） ,美人鱼发光杆菌（Photobacterium damselae subsp.damselae） ,河弧菌（V.fluvialis） ,弗尼斯弧菌（V.furnissii）和创伤弧菌（V.vulnificus） ,而另外7株弧菌标准菌株中无杂交信号。所有的哈维氏弧菌菌株至少含有一条杂交带,其中菌株VIB645 , VIB 648和SF-1分别含有2条杂交带。11株副溶血弧菌中均含有一条杂交带。上述数据表明,vhh/tlh溶血素基因广泛分布于弧菌中,尤其是哈维氏弧菌相关菌株和费氏弧菌相关菌株中。另外对鳗弧菌VIB 72 ,坎贝氏弧菌VIB 285 ,飘浮弧菌VIB 299和哈维氏弧菌VIB 647的vhh/tlh溶血素基因进行克隆并测序,其氨基酸序列与VHH溶血素和TLH溶血素氨基酸序列的同源性分别为67 %~99 %和69 %~91 %。对vhh/tlh溶血素基因在弧菌中的分布研究,将有助于进一步确定这类溶血素基因在病原弧菌致病性中的作用。

副溶血弧菌tlh基因缺失株的构建

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticuss,VP)是我国海水养殖鱼、虾、贝类的重要病原,其主要致病因子热不稳定性溶血素(thermolabile hemolysin,TLH)的功能和致病性仍不十分清楚。本研究利用PCR技术从VP临床分离株的基因组DNA中扩增出tlh基因,利用同源重组技术,构建了副溶血弧菌tlh基因打靶载体;利用PCR方法筛选tlh基因缺失株,并在卵磷脂存在条件下进行溶血性检测,结果在5%兔血平板上能够引起溶血,5%的马血琼脂平板未出现溶血现象,说明tlh基因敲除成功。本研究成功构建了副溶血弧菌tlh基因缺失株,为进一步研究tlh基因致病性和溶血机制提供了必要的实验菌株,为副溶血弧菌其他基因的敲除提供了可行性依据。

半定量RT-PCR检测副溶血弧菌tlh基因的表达差异

副溶血弧菌是广泛存在于近海区域、盐湖和海产品中的食源性致病菌,会引起大规模的食物中毒。TLH是副溶血弧菌最主要的毒力因子之一,通过比较tlh的表达量可以间接比较同种菌株在不同应激条件下以及不同菌株之间的毒力差异。本文以在不同条件下培养的三株Vp为材料,分别提取其总RNA,以16SrRNA为内标基因,运用半定量反转录—多聚酶链反应(RT-PCR)检测副溶血弧菌不耐热溶血毒素(tlh)基因在不同应激条件下的表达差异。结果表明,在5%的盐度下,三株Vp的tlh基因的表达量都高于其他盐浓度;25℃下,tlh的表达量高于在其他温度条件下;在三株Vp中,ATCC33846中tlhmRNA的表达量最低,ATCC33847中的表达量最高。

副溶血性弧菌不耐热溶血素的生物信息学分析与分子动力学模拟

副溶血性弧菌是一种革兰氏阴性人畜共患致病菌,可引发人类胃肠炎等食源性疾病。副溶血性弧菌具有多种毒力因子,热不稳定溶血素(thermolabile hemolysin,TLH)即是其中之一。该研究对副溶血性弧菌的tlh基因进行了克隆及测序,对tlh基因编码的TLH蛋白进行了生物信息学分析及结构和功能预测。结果表明,TLH蛋白由418个氨基酸组成,预测分子质量为47.36 kDa。在TLH蛋白中确定了几个保守的结构域和基序,包括SGNH水解酶结构域和GDSL基序;对TLH蛋白的三维结构进行了同源建模及验证,在此基础上通过分子动力学模拟分析其稳定性、与4-硝基苯基月桂酸酯(p-nitrophenylaurate,PNPL)的相互作用能力及结合底物对结构紧密度和残基灵活性的影响,揭示了催化三联体Ser153-His390-Asp393周边是一个重要的药物靶点活性口袋,具有高度保守的残基序列,并在底物结合后表现出残基灵活性差异。该研究分析了副溶血性弧菌TLH蛋白的性质和结构,可以为保障水产品的安全性、提高水产品原料安全评价水平提供理论支持。

副溶血弧菌与嗜水气单胞菌双重PCR检测方法的建立

为建立一种可精准、快捷鉴别检测副溶血弧菌(VP)及嗜水气单胞菌(AH)的方法,根据GenBank公布的VP Tlh基因及AH aerA基因保守区序列,设计合成两对特异性引物,通过优化反应体系及反应程序,成功建立了一种可同时检测VP与AH的双重PCR方法,并开展了特异性及敏感性试验。结果显示:VP Tlh和AH aerA基因扩增条带大小分别为500、760 bp;反应体系中Tlh与aerA基因引物最优浓度分别为7.5、10.0 nmol/L,反应程序中最佳退火温度为56.8℃;该方法对VP、AH的最低可检出细菌浓度均为1.2×10^(3)CFU/mL;对地衣芽孢杆菌、微小杆菌、巨大芽孢杆菌、蜡阳芽孢杆菌、普通变形杆菌、维氏气单胞菌、布氏柠檬酸杆菌、豚鼠气单胞菌、霍乱弧菌、拟态弧菌、简氏气单胞菌等其他非目标菌均无交叉反应,仅对VP和AH呈特异性阳性扩增。综上,本研究建立了一种可快速鉴别诊断VP、AH的双重PCR检测方法,其特异性强、灵敏度高,可为VP、AH等细菌性病原引发的水生动物疫病的快速诊断、监测及有效防控提供技术支持。

新型恒温核酸扩增法快速检测副溶血性弧菌的研究

利用DNA环介导恒温核酸扩增法(loop-mediated isothermal amplification of DNA,LAMP)设计一对外引物和一对内引物,通过引物特异性识别tlh基因上的六个独立区域来快速检测副溶血弧菌。同时将检测结果与PCR方法进行比较。结果表明,LAMP反应在65℃恒温条件60min内完成,凝胶电泳呈现梯型条带;肉眼观察阳性结果出现白色混浊现象,添加1×SYBRGreenI荧光染料后,绿色的阳性结果很明显区别于橙色阴性结果;LAMP方法的最低检出限为10CFU/ml,PCR方法为103CFU/ml,LAMP方法检测灵敏度是PCR方法的100倍。因此,LAMP方法用于快速检测副溶血弧菌具有检测过程简单、反应结果肉眼即辨别并且灵敏度高特异性强的特点。实验装置简便,能够提供稳定热源即可,所以LAMP方法特别适合于现场快速诊断。

菌落PCR方法的建立及其与常规PCR方法的比较

为建立一种快速、经济、敏感的PCR检测方法 ,以直接检测出环境、海产品等中的靶基因 ,通过PCR扩增已知携带tlh和tdh基因的副溶血弧菌标准菌株 ,并和常规PCR方法比较 ,初步建立了菌落PCR技术 ;再以副溶血弧菌标准菌株为阳性对照 ,以本实验室自海洋环境中分离得到的数株野生菌株为检测对象 ,采用新建立的菌落PCR以及常规PCR方法对它们进行扩增比较 ,进一步证明了菌落PCR技术检测携带相关基因菌株的可靠性 .通过比较 ,发现菌落PCR和常规PCR的结果相当一致 。

基于特异性基因的副溶血性弧菌快速分离鉴定

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是海洋环境中常见的食源性致病菌。采用自行设计的改良初筛方案结合tlht、oxR这2种特异性基因的2次筛选开发了一种副溶血性弧菌的快速分离鉴定方法。应用该法从海水、海泥及3种海产品中分离得到了19株副溶血性弧菌,再经16S rDNA测序对分离鉴定结果的特异性进行了验证。实验结果显示基于tlht、oxR这两种特异性基因分离鉴定所得19株菌的准确性为100%,全程检测时间为3 d。上述结果显示本研究开发的基于特异性基因的副溶血性弧菌分离鉴定法是一种高效、快速的检测方法,特异性强且耗时短,在食源性致病菌的风险评估和大规模样本的分析检测领域具有较高的潜在应用价值。

副溶血弧菌LAMP检测方法的建立

副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一种能引起食源性疾病的重要病原菌。首次将一种新颖的核酸扩增技术-环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)应用于副溶血弧菌的快速检测。针对副溶血弧菌不耐热溶血毒素基因(tlh)设计4条特异性引物(两条内引物和两条外引物)进行LAMP扩增,对扩增反应进行优化,最佳反应时间为60min,反应温度为60℃。对12种细菌共28株菌进行LAMP扩增,仅14株副溶血弧菌得到阳性扩增结果,证明引物具有很高的特异性。副溶血弧菌基因组DNA和纯培养物的检测灵敏度分别约为90fg和24cfu/ml。对模拟食品样品进行直接检测,检测限为89cfu/g。结果表明,该方法检测副溶血弧菌特异性强、灵敏度高,并且操作简便、检测成本低,1小时即可完成,有望发展成为快速检测副溶血弧菌的有效手段。

基于TaqMan探针的双重荧光定量PCR方法检测海产品中的副溶血弧菌

目的建立海产品中副溶血弧菌检测的双重荧光定量PCR体系。方法针对副溶血弧菌种特异性基因tlh和tdh设计引物和TaqMan探针,建立双重荧光定量PCR体系,进行特异性与敏感性研究;利用该体系检测海产品中的副溶血弧菌。结果副溶血弧菌可得到特异性扩增,而其它与副溶血弧菌共存于海产品中的细菌均未见扩增曲线。副溶血弧菌与其它细菌的混合DNA检测表明,其它细菌基因组的存在时并不干扰副溶血弧菌检测。副溶血弧菌典型菌株FJ14和BJ97的敏感性试验显示,该体系的最低检测DNA浓度分别为49.8pg与77.8pg,最低检测细菌浓度为56CFU/mL和371CFU/mL。对舟山菜市场采集的50份样本检测表明,32份为tlh基因阳性,3份为tdh基因阳性,与传统方法的检测结果相同。结论与传统检测方法相比,副溶血弧菌的双重荧光定量PCR检测方法快速准确,结果直观。

副溶血弧菌重组酶聚合酶扩增快速检测方法的建立及初步应用

为建立副溶血弧菌快速检测方法,本研究以副溶血弧菌不耐热溶血素(tlh)基因作为靶序列设计特异性引物,经反应条件优化建立了检测副溶血弧菌的重组酶聚合酶扩增(RPA)方法。优化试验结果显示该方法在37℃和35 min条件下检测效果最佳;特异性试验结果显示,该方法除对副溶血弧菌的检测结果为阳性外,对其余8种常见的弧菌检测结果均为阴性,特异性较强;敏感性试验结果显示,该RPA方法对副溶血弧菌的检出限为104cfu/mL,敏感性较高。利用建立的RPA检测方法、培养法及普通PCR方法同时对采集的48份海鲜样品进行检测,结果显示:该RPA方法能够对临床样品快速检测,并且检测结果与国家标准培养法及普通PCR方法的符合率为100%,能够满足临床样品的检测需求。本研究建立了一种检测副溶血弧菌的方法,该方法具有反应快速、特异性强、敏感性高等特点,为副溶血弧菌的快速检测奠定基础。

荧光定量PCR法检测副溶血弧菌tlh和tdh基因的表达差异

副溶血弧菌是广泛存在于近海区域,盐湖和海产品中的食源性致病菌,会引起大规模的食物中毒。TLH(不耐热溶血毒素)和TDH(耐热直接溶血毒素)是副溶血弧菌最主要的毒力基因,通过比较毒力基因的表达量可以间接比较同种菌株在不同应激条件下以及不同菌株之间的毒力差异。本文以在不同条件下培养的3株Vp为材料,分别提取其总RNA,以16S rRNA为内标基因,运用荧光定量PCR技术检测副溶血弧菌TLH和TDH基因在不同应激条件下的表达差异。结果表明:不同菌株和同种菌株在不同应激条件下tlh、tdh基因表达差异均显著;tlh的最适表达条件分别为5%盐度和20°C;tdh的最适表达条件分别为1%盐度和25°C。运用SPSS软件对实验结果进行统计学分析表明:菌株对tlh表达的影响大于盐度大于温度;菌株对tdh表达的影响大于温度大于盐度。

基于tlh基因病原副溶血弧菌LAMP检测方法的建立

为了研究副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)的快速分子生物学检测方法,试验以副溶血弧菌特异性tlh基因为分子靶标设计引物,利用环介导恒温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术建立病原副溶血弧菌的快速检测方法。结果表明:特异性检测仅副溶血弧菌基因组DNA可扩增出阶梯状条带,且反应产物中加入荧光染料SYBR GreenⅠ后呈现明显的绿色阳性反应;而鳗弧菌、河口弧菌、美人鱼弧菌、霍乱弧菌、哈氏弧菌、鱼肠道弧菌这6种对照病原菌均未出现任何扩增条带,且反应产物中加入荧光染料SYBR GreenⅠ后呈现橙色阴性反应;灵敏度检测的最低检测限为42 cfu/mL;对人工染菌的9种水产品检测均可获得阳性扩增结果;该方法检测时间从核酸抽提到结果分析仅需1 h左右,较传统方法操作简单、耗时短、不需昂贵仪器。说明该方法可用于针对副溶血弧菌的进出口检验检疫、食品安全检测及由该菌引起的水产动物疾病的诊断与分子流行病学调查。

水产品中副溶血性弧菌LAMP检测方法的优化

本文用副溶血性弧菌不耐热溶血素(tlh)基因作靶标,优化环介导等温扩增技术检测水产品副溶血性弧菌的方法。体系用Bst DNA聚合酶催化,恒温反应60 min,产物分别用2%琼脂糖凝胶电泳和SYBR Green I染色鉴定,对各项反应参数进行优化;将新鲜菌液作10倍梯度稀释后进行LAMP和PCR反应,比较二者的敏感度;对32株食源性病原菌(包括分离于水产品的25株副溶血弧菌,1株副溶血性弧菌ATCC17802标准株,大肠杆菌D5、金黄色葡萄球菌CMCC26003、志贺氏菌B4、蜡样芽胞杆菌63302、单核细胞增生李斯特菌54001和沙门氏菌50041各1株)进行LAMP扩增,验证其特异性;虾样品用菌液进行模拟污染,分析LAMP的可靠性。各参数最佳条件为:Mg2+浓度为3.6 mmol/L,d NTPs浓度为0.96 mmol/L,Bst DNA聚合酶用量为4.8 U,内外引物浓度比为8:1,最佳反应温度为63℃,时间为60 min;LAMP的检测限为1 CFU/m L,低于PCR方法的最低检测限;特异性试验检测26株副溶血性弧菌均为阳性,6株非副溶血性弧菌为阴性;人工污染试验中检测限达1 CFU/m L,无假阳性。建立的LAMP方法操作简单且灵敏度高,适用于水产食品中副溶血弧菌的现场快速检测。

四重PCR检测副溶血性弧菌及其毒力基因方法的建立

【目的】建立同时检测副溶血性弧菌tox R、tdh、trh、tlh基因的四重PCR快速检测方法。【方法】分别以副溶血性弧菌的tox R、tdh、trh、tlh 4个基因为靶基因,设计4对特异性引物,对4对引物浓度和退火温度进行优化,获得最佳引物比例和扩增条件,建立快速检测致病性副溶血性弧菌的四重PCR体系。通过特异性验证、灵敏度验证以及模拟样品检测进行方法确认。【结果】四重PCR体系扩增条带与预期相符,即115 bp(tox R)、244 bp(tdh)、418 bp(trh)、759 bp(tlh)4个目的条带;用74株副溶血性弧菌和37株非目标菌的测试结果表明,所建立的方法有良好的特异性。该方法对模板DNA的检测灵敏度为50μg/L,纯培养物的检测灵敏度为6.7×103 CFU/m L;副溶血性弧菌含量为1.36 CFU/g的人工模拟样品增菌6 h后,tox R、tlh、tdh、trh 4个基因可同时被检出。【结论】该方法可实现同时检测携带tox R、tdh、trh、tlh 4种基因的副溶血性弧菌,对开展致病性副溶血性弧菌的检测研究具有一定现实意义。

基于颜色判定的环介导恒温扩增法快速检测副溶血性弧菌

利用DNA环介导恒温核酸扩增法(LAMP)针对副溶血性弧菌特异基因tlh基因设计4条引物,通过引物特异性识别tlh基因上的6个独立区域来快速检测副溶血性弧菌.LAMP反应的过程中会产生白色沉淀焦磷酸镁,故可以通过监测浊度来判定反应结果.实时浊度仪监测反应结果表明,LAMP反应在60～65℃恒温条件下50min内完成;如果在反应前添加羟基萘酚兰(HNB),蓝色的阳性结果很明显区别于紫色阴性结果;LAMP方法的最低检出限为9.74pg/μL,PCR方法最低检出限为97.4pg/μL,LAMP方法检测灵敏度是PCR方法检测灵敏度的10倍,且具有良好的特异性.LAMP方法用于快速检测副溶血性弧菌具有检测过程简单、实验装置简便、反应结果肉眼可辨别、灵敏度高和特异性强的特点,所以LAMP方法检测副溶血性弧菌特别适合用于现场和基层检疫及医疗单位的快速诊断.

应用SYBR Green Ⅰ荧光PCR快速检测副溶血弧菌及其毒力基因

目的利用SYBR Green Ⅰ荧光PCR反应检测副溶血弧菌及其trh和tdh毒力基因。方法根据副溶血弧菌tlh基因设计引物,建立检测副溶血弧菌SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法,利用33株副溶血弧菌分离株以及22株其他种属细菌进行特异性和灵敏度评价。根据副溶血弧菌trh和tdh毒力基因序列设计引物,建立检测副溶血弧菌毒力基因的单重和双重SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法,并对这两种方法进行特异性和灵敏度评价。结果本研究中基于tlh基因的荧光PCR检测对全部33株副溶血弧菌检测为阳性,检测下限为5×101拷贝/μl,而22株其他种属细菌均为阴性。毒力基因trh和tdh均能特异性检测,其单重荧光PCR检测下限为5×101拷贝/μl,双重荧光PCR检测下限为5×102拷贝/μl。结论本研究建立了tlh作为靶基因检测副溶血弧菌的单重SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法和同时检测副溶血弧菌trh和tdh毒力基因的双重SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法,简化了毒力基因检测,有良好的实际应用前景。

北京市水产品污染与感染病例中副溶血性弧菌血清型和毒力基因型的比较研究

目的对北京市夏季市售水产品污染与感染病例中副溶血性弧菌血清型和毒力基因型进行比较研究,为评估食品安全风险监测的目的与意义提供思路,为北京市水产品副溶血性弧菌污染与临床感染病例的关联性研究提供技术支持。方法对采集的水产品样品和哨点医院腹泻患者粪便样本进行副溶血性弧菌的分离鉴定,采用血清玻片凝集法对分离出的副溶血性弧菌进行血清分型,PCR方法检测菌株的tlh、tdh、trh基因。结果 2014年7~9月共采集水产品样品164份,检出副溶血性弧菌80份,总污染率为48.78%;其中淡水产品污染率为38.78%(19/49),平均菌量浓度为66.63 MPN/g;海水产品污染率为53.04%(61/115),平均菌量浓度为38.14 MPN/g。80株副溶血性弧菌分属于9个血清群,其中O2群28株,占35.00%,O1群11株,占13.75%,O5群10株,占12.50%。80株菌tlh基因均为阳性,只有1株菌携带tdh毒力基因,所有菌株trh毒力基因均为阴性。哨点医院腹泻病人粪便样本中分离鉴定副溶血性弧菌21株,血清型O3∶K6占61.90%(13/21),O4:K8占28.57%(6/21);毒力基因型tdh(+)/trh(-)占95.24%(20/21),tdh(-)/trh(-)占4.76%(1/21)。结论来源于食品样品的副溶血性弧菌绝大部分不具备致病性,而导致消费者腹泻的副溶血性弧菌绝大部分携带致病性毒力基因,表明目前的食品安全风险监测结果不能作为评估副溶血弧菌导致的食源性疾病暴发和散发的依据。