五种药剂对烟草青枯病菌的抑制活性及碳代谢的影响

由茄科劳尔氏菌Ralstonia solanacearum引起的烟草青枯病是烟叶生产上的重要病害之一,严重影响烟叶的产量和品质。为筛选高效防治烟草青枯病的药剂,本研究采用平板菌落计数法测定了中生菌素、土霉素、噻霉酮、春雷霉素和氯溴异氰尿酸对茄科劳尔氏菌的抑制活性,并通过Biolog GENⅢ微平板法分析了上述5种药剂胁迫下茄科劳尔氏菌的碳代谢情况和对化学物质的敏感性差异。结果表明:5种药剂均能抑制茄科劳尔氏菌的生长,抑制活性从强到弱依次为中生菌素>土霉素>噻霉酮>春雷霉素>氯溴异氰尿酸,对应的EC_(50)值分别为0.24、0.74、2.84、7.95和273.99 mg/L。Biolog GENⅢ碳代谢测定结果显示:茄科劳尔氏菌能利用Biolog GENⅢ微平板中糖类及氨基酸类等71种碳源,但在药剂胁迫下,该菌对碳源的代谢受到了不同程度的抑制,其中抑制程度最显著的是氨基酸、己糖酸、羧酸、酯和脂肪酸类碳水化合物;随着5种药剂质量浓度增加,在6 mg/L中生菌素、8 mg/L土霉素、30 mg/L春雷霉素和5738 mg/L氯溴异氰尿酸胁迫下,茄科劳尔氏菌对Biolog GENⅢ微平板中65、18、60和7种碳源的代谢强度分别降低,同时对6、53、10和60种碳源的代谢强度增强;在8 mg/L噻霉酮胁迫下,茄科劳尔氏菌对Biolog GENⅢ微平板中71种碳源的代谢强度均降低。此外,在不同浓度的5种药剂胁迫和无药剂处理时,茄科劳尔氏菌对Biolog GENⅢ微平板中23种化学物质的敏感性不同,其对低浓度NaCl敏感性较低,而对低pH值更敏感。本研究结果可为烟草青枯病化学防控药剂的选择及其高效利用提供参考。

烟草根际细菌铜绿假单胞菌swu31-2的定殖能力及其对烟草青枯病的防治作用

从重庆黔江烟草田间分离获得一株烟草青枯菌拮抗菌株Pseudomonas aeruginosaswu31-2(简称swu31-2)。采用逐步提高药物浓度的方法,筛选获得了抗链霉素300μg/mL对烟草青枯病菌拮抗活性稳定的swu31-2突变菌株。采用灌根接种法,研究其在烟草根、茎和叶表面及内部的定殖能力及其对烟草青枯病的防治作用。结果表明,swu31-2能在烟草各组织的表面及内部定殖。该菌株在烟草各组织内部的数量均表现为"由增到减"的趋势。在接种后第8天定殖数量达到最高峰,随后有所下降;到第20天各组织内的数量仍然维持较高水平(105cfu/g以上)。同时,在接种20 d后,烟草的根、茎和叶的表面仍然可以检测到swu31-2的存在。盆栽试验结果表明,swu31-2的菌液和活性物质对烟草青枯病均有一定的防治效果。其中先施swu31-2菌液和活性物质粗提物的防效好于农用链霉素(51.25%),分别为60.87%和60.32%,而后施菌液和活性物质粗提物的防效也分别达39.50%和20.90%。

烟草青枯病的研究进展

烟草青枯病是一种世界普遍发生的重要病害 ,对该病病原、寄主范围、地理分布、环境与病害的流行以及综合防治进行了综述。

作物轮作对土壤中烟草青枯菌数量及发病的影响

为查明春烟换茬后青枯菌在土壤中的消长规律,采用接种耐药性青枯菌的盆土种植烟草,烟草枯死后种植不同轮作作物的方法,研究不同作物对土壤中青枯菌数量及其越冬状况的影响。设茄子、大豆、花生、甘薯、大蒜、玉米、晚稻和双季稻8个轮作物处理,后作生长期间定期取样,用含利福平的选择性培养基检测样品中的青枯菌数量。结果表明,栽后第4周起秋茄子和秋大豆根中皆测出青枯菌,秋茄子根达106 cfu·g-1;晚稻和秋花生根只第2周和第8周测出带菌。秋茄子、秋大豆、秋花生和晚甘薯生长期间土壤皆测出青枯菌,数量先降后升至104～106 cfu·g-1;晚稻和秋玉米土壤中青枯菌数量持续下降;大蒜处理先测出带菌后未测到。冬季对水稻残桩青枯菌数量监测显示,稻桩根和土壤中青枯菌数量先后出现峰值,分别达1.00×105 cfu·g-1和5.17×104 cfu·g-1;发现病菌能在稻根变黑腐烂时增殖。翌年春季从茄子、大豆、花生和甘薯茬口土壤中测出遗留青枯菌数量皆达104 cfu·g-1,玉米为103 cfu·g-1。烟草移栽后青枯病调查表明,不同处理发病迟早取决于茬口土壤中菌源数量,两者相关系数r为0.908 9。不同茬口土壤发病轻重有显著差异,茄子茬土发病最重,病情指数100,大豆和大蒜茬土发病略重于花生、甘薯和玉米茬土;晚稻茬土发病最轻,病情指数16.7,与茄子茬土相比发病期推迟20 d,病情指数下降83.3%;双季稻茬土未见发病,证明烟稻轮作对青枯病有较好的控制效果。

抗烟草青枯病菌的枯草芽孢杆菌SH7的筛选与鉴定

由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)侵染引起的烟草青枯病是我国烟区的主要病害之一,严重影响烟草的产量和品质。从云南和贵州烟草青枯病重病区采集600份健康烟草根基土壤,并从中筛选出1株对R.solanacearum具有较强拮抗活性的细菌菌株SH7,该菌株在室内平板抑菌试验中,对R.solanacearum抑菌带宽可达13.2 mm。预先用SH7无菌发酵液保护烟株根部,对R.solanacearum防效达到66.0%。SH7发酵液经70%(NH4)2SO4饱和度沉淀并透析后得到的蛋白粗提液经平板抑菌活性检测,对R.solanacearum具有很强的抑菌活性,抑菌带宽为15.7 mm。初步确定SH7菌株产生的主要抑菌活性物质为蛋白多肽类物质。经菌体形态学、生理生化测定和16s rDNA序列测定,结果表明:SH7菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

江西省抚州烟区青枯雷尔氏菌的分离鉴定与遗传多样性分析

为揭示青枯雷尔氏菌的遗传多样性,进而有效防治烟草青枯病,从江西省抚州市宜黄、黎川、乐安、广昌、资溪和南丰等烟叶产区采集青枯病发病烟株进行病菌分离,并以青枯雷尔氏菌种特异引物759/760进行PCR鉴定,获得了青枯雷尔氏菌33株。同时采用RAPD熔解曲线分析法(McRAPD)及内切葡聚糖酶基因(egl)测序法进行遗传多样性分析,确定其序列变种。McRAPD结果显示,多数青枯雷尔氏菌菌株遗传分化与地理来源相关性不强。egl基因测序结果表明,33株菌属于亚洲分支(演化型Ⅰ)的序列变种13、15、17和34,序列变种和地理来源具有较强相关性。序列变种15菌株占比最高,为57.6%,19株分离自广昌、黎川、乐安、南丰、宜黄和资溪等6县10个乡镇,是优势序列变种。序列变种17占比最少,为9.1%,3株全部分离自宜黄县黄陂镇。而4株序列变种34主要分离自乐安县增田镇,黎川县潭溪乡和资溪县高阜镇,占比12.1%。广昌县尖峰乡和头陂镇,南丰县傅坊乡和太源乡等产区在云烟87上分离到序列变种13,占分离菌株的21.2%,在江西省抚州市为首次发现。

抗烟草青枯菌菌株的分离、鉴定和发酵条件研究

烟草青枯病是一种全球性的土传性病害,其危害严重,每年都给烟草行业带来巨大的损失.筛选对烟草青枯病的致病菌青枯劳尔氏菌有较好拮抗作用的菌株,用分子生物学方法鉴定其种属,并对拮抗菌株的发酵条件进行初步研究,为烟草青枯病生物防治奠定基础.测试菌共246株,来自从土壤样品中分离得到的155株菌株和实验室保藏91株.以强致病青枯菌为测试菌,用双层平板法筛选得到2株拮抗菌.16SrDNA序列分析表明,这两株分别为娄彻氏链霉菌和短小芽孢杆菌.对活性较好的链霉菌开展进一步的发酵条件研究,初步获得活性最佳的发酵条件和生物量最大的培养条件.为防治烟草青枯病提供了新的菌株.

云南省烟草青枯病的侵染动态

为了指导烟草青枯病的测报和防治,采用定期挖根调查采样和ELISA检测方法,对云南省烟草青枯病的侵染动态进行了研究。移栽后每周挖根调查结果和根、茎部样品的检测结果表明,在文山州青枯病重病田块,移栽后第5周根部样品首先检测出青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum,简称青枯菌)阳性,个别烟株根部出现黑色坏死症状;移栽后第7周根部样品青枯菌检出率达到50%左右、根部黑色坏死发病率开始快速上升,茎部无明显症状;移栽后第9周,根部发病率达到50%左右、个别烟株茎部出现黑色坏死症状。移栽后第12周,茎部青枯菌检出率、根发病率和茎部发病率均达到80%以上。根部样品青枯菌检出阳性、烟株根部显症、烟株茎部显症表现出一定的时间顺序(先后间隔约21d)。根青枯菌检出阳性时期和根黑色坏死的始发期可作为确定第一次施药时期的依据。对ELISA检测的验证试验结果表明,ELISA检测为青枯菌阳性的样品,可分离到典型青枯菌菌落,分离物ELISA检测同样为青枯菌阳性。

江西烟草青枯病菌的分子鉴定及系统发育分析

从江西省信丰、广昌和峡江3县采集呈典型症状的烟草青枯病株进行病原菌分离,得到3个具有致病性的细菌分离株,分别命名为RSXF-1、RSGC-1和RSXJ-1。采用细菌16S rDNA基因通用引物对3个分离株的16S rDNA基因进行PCR扩增,对扩增产物进行克隆和序列测定,各得到长为1 500 bp的核苷酸序列。经同源性分析,发现3个分离株均为茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum),且三者间具有高度的序列同源性。将此3个分离株的16S rDNA核苷酸序列与GenBank中R.solanacearum代表性株系的对应序列进行同源性分析并构建系统发育树,结果表明RSXF-1、RSGC-1和RSXJ-1均与我国广东省和云南省的分离株具有最近的亲缘发育关系。

我国烟草青枯菌的种下多样性及统一用名问题商榷

烟草青枯病在我国许多烟区普遍发生,17个主要烟草种植区中有14个发生了青枯病,近年来,该病的危害范围有逐渐向北和冷凉地区扩展蔓延之势,造成了严重的经济损失.在传统分类中烟草青枯菌属于生理小种1号;在生化变种及演化型分类中,我国大多数烟草菌株为生化变种3(但也有部分为生化变种4),演化型Ⅰ,而美洲的烟草青枯菌则属于生化变种1,演化型Ⅱ;烟草青枯菌具有序列变种多样性,美洲菌株可聚类为序列变种7和25等,中国烟草青枯菌则属于序列变种13,14,15,17,34,44,54和55.学者们基于DNA-DNA杂交、基因组、蛋白质组及代谢组等证据提议将青枯菌这一复合种重新划分为3个新的种,即Ralstonia solanacearumsp.nov.(原本的演化型Ⅱ菌株),R.syzygii sp.nov.(原本的演化型IV菌株,包括苏门答腊病的病原及香蕉血液病细菌),R.pseudosolanacearumsp.nov.(原本的演化型Ⅰ和演化型Ⅲ菌株).基于此,美洲烟草青枯菌菌株为R.solanacearum,而我国的烟草青枯菌菌株为R.pseudosolanacearum,建议将我国烟草青枯病菌的中文名称为:假茄科雷尔氏菌.

施钾调控烟草根系酚酸的释放及其防控青枯病的研究

针对贵州烟草产区青枯病发病普遍和防治此病害研究不够深入的现状,本文通过田间试验研究了施用不同量的钾肥对烟草青枯病的防控效果,同时测定根系分泌物中的酚酸种类和含量,及其对烟草青枯病病原菌(Ralstonia solanacearum)的抑制作用,为农业措施上防控病害提供科学依据。结果表明,当田间施用150 kg/hm^2的钾肥时,烟草青枯病发病率和病情指数最低,根际土壤中青枯病原菌的数量最少,为5.6 log cfu/g,而无钾肥处理的发病程度最高。同时,测定烟草根系分泌物中的酚酸发现,150 kg/hm^2处理的肉桂酸、水杨酸和苯丙酸释放量最高。外源添加酚酸对青枯病病原菌的生长结果表明,低浓度促进了菌丝的生长,当浓度达到600 mg/L时表现为抑制的作用。此外,在田间中施钾肥显著提高了烟草的生物量、钾浓度和总酚含量。本研究结果表明,施用150 kg/hm^2的钾肥时,能在生产上有效的防控烟草青枯病,其根系分泌物中的酚酸能显著抑制致病菌的生长。

浅议烟草青枯病

烟草青枯病是一种世界普遍发生的重要病害,对该病病原传播、发病症状、发病规律、与发病原因以及综合防治进行了简要介绍。

生物有机肥对烟草青枯病的田间防效及根际土壤微生物的影响

[目的]本试验旨在研究生物有机肥对烟草青枯病的田间防效及其对烟草根际病原菌数量和土壤微生物功能多样性的影响。[方法]试验采用由拮抗菌经二次发酵制成的生物有机肥对2个青枯病发病严重的田块进行田间烟草青枯病害防控试验,2个田块的处理相同,分别为常规施用无机肥处理(CK)和无机肥配施生物有机肥处理(BOF),2个田块分别标记为CK1、BOF1和CK2、BOF2。通过测定不同处理的青枯病发病率和烟叶产量,探究生物有机肥的田间防效。利用荧光定量PCR研究根际土壤病原菌数量变化,并用Biolog-ECO板研究不同时期根际土壤微生物功能多样性。[结果]BOF1和BOF2处理对烟草青枯病的防控率分别达到68.1%和70.5%,烟叶产量分别提高8.9%和10.8%,产值分别提高24.9%和25.9%;施用生物有机肥能显著降低根际土壤青枯菌的数量,在移栽后40、60和80 d BOF处理的青枯菌数量均比CK处理少1个数量级;施用生物有机肥能显著增加烟草根际土壤微生物的功能多样性,改变根际土壤微生物群落结构。[结论]在大田中施用生物有机肥通过减少根际土壤病原菌数量和增加根际土壤微生物功能多样性,对烟草青枯病具有较好的防控效果。

不同烤烟品种对青枯病胁迫的生理响应及抗性分析

为明确不同抗性烤烟品种(系)对青枯病侵染的响应机制,以抗病品种(系)岩烟97、G80、633K和易感品种翠碧一号、红花大金元为材料,通过盆栽试验研究了青枯菌侵染胁迫下不同抗性烤烟品种(系)发病情况、生物量、激素、丙二醛(MDA)含量及抗氧化酶系活性的变化。结果表明,易感品种的发病率和病情指数高于抗病品种,红花大金元和翠碧一号的发病率和病情指数分别达到80%、68.89和70%、41.11;与未接种青枯菌烟株(CK)相比,接菌后所有品种(系)的生物量和丙二醛(MDA)含量均显著下降,抗病品种(系)生物量降幅均显著小于易感品种,633K生物量降幅最小为37.47%,红花大金元降幅最大为84.01%。抗病品种(系)MDA含量降幅均显著大于易感品种,633K降幅最大为45.67%,红花大金元降幅最小为13.02%;各品种受青枯菌胁迫后超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性均显著提高,抗病品种(系)的增幅大于易感品种;抗病品种(系)的茉莉酸(JA)和水杨酸(SA)含量均显著增加,易感品种SA含量显著增加,而JA含量显著降低。在青枯菌侵染胁迫下,抗病品种能够更有效地响应青枯菌侵染胁迫并作出应答,以此来抵御病原菌的侵染。

烟草青枯病菌拮抗细菌的筛选、鉴定和抑菌机制研究

青枯雷尔氏菌Ralstonia solanacearum造成的烟草青枯病是烟草主要毁灭性病害之一。本研究采用牛津杯法从运城盐湖湖岸土壤中筛选获得一株对烟草青枯病菌具有较好拮抗效果的菌株FY−C;并进一步分析了菌株FY−C的抑菌谱、对青枯病菌的潜在生防效果。结果显示,经菌株FY−C无菌滤液处理24 h后的青枯病菌细胞壁降解,内容物外渗;且对青枯病菌产生的抑菌活性表现出较强的热稳定性、酸碱稳定性。通过形态、生理和系统发育分析将菌株FY−C鉴定为贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensis,且菌株FY−C对多种病原真菌都有抑制作用。促生试验显示,菌株FY−C发酵液灌根处理烟草45 d后,株高和鲜重分别比对照提高28.54%和24.90%;防治试验显示,菌株FY−C发酵液灌根预处理5 d后接种青枯病菌较对照处理(LB处理)防效增长了59.74%。此外,发现菌株FY−C具有分泌纤维素酶、蛋白酶及生成生物膜的能力。综上,贝莱斯芽胞杆菌FY−C具有较大的生防潜力,能够为植物病害的绿色防控提供研究思路。

试验土壤中烟草青枯病菌的RT-qPCR检测分析

为有效防治烟草青枯病,利用实时荧光定量PCR(Real-time quantity PCR,RT-qPCR)技术,对土壤中烟草青枯病菌进行了定量检测,并建立了土壤中烟草青枯病菌的RT-qPCR检测方法。结果表明,该方法对试验土壤青枯菌的最低检测浓度为5×10~2cfu/g土壤,RT-qPCR检测技术对土壤中烟草青枯病菌的灵敏度比常规PCR检测技术提高了10倍。

健康与感染青枯病烟株根际土壤与茎秆真菌群落结构与多样性

为研究感染青枯病后烟株根际土壤与茎秆真菌群落结构与多样性的变化,对健康和感染青枯病烟株的根际土壤、病株茎秆发病组织和健株茎秆健康组织等样品中真菌ITS区的rDNA进行了PCR扩增、用Illumina MiSeq测序技术对扩增DNA片段进行高通量测序,并分析不同样品的真菌群落组成与多样性。结果表明,所有烟株根际土壤中优势门为子囊菌门Ascomycota和接合菌门Zygomycota;所有茎秆样品中优势门为担子菌门Basidiomycota和子囊菌门。在属水平,被孢霉属Mortierella、镰刀菌属Fusarium和隐球菌属Cryptococcus为所有土壤中的主要菌属,Boeremia主要存在于发病烟株根际土壤中,而木霉属Trichoderma主要存在于健康烟株根际土壤。发病茎秆病害组织中优势属为小画线壳属Monographella、隐球菌属、鬼伞属Coprinopsis和赤霉属Gibberella;发病茎秆病健交界处组织中优势属为隐球菌属、红酵母属Rhodotorula和小画线壳属。健康烟株茎秆组织中优势属为隐球菌属、链格孢属Alternaria和红酵母属;健康烟株中与发病茎秆病健交界处组织等高茎秆中优势属为镰刀菌属、隐球菌属、链格孢属和Gibellulopsis。青枯菌侵染烟株后根际土壤、发病茎秆病害组织和发病茎秆病健交界处组织的真菌群落中物种丰富度与多样性均显著提高,且发病茎秆病害组织与发病茎秆病健交界处组织真菌群落的变化大于根际土壤。研究结果为烟草青枯病的生物防治提供了参考。

烈性青枯雷尔氏菌噬菌体的分离与生物学特性分析

为采用噬菌体疗法防治烟草青枯病,以烟草青枯菌TB15-15为宿主菌,从土壤中筛选分离得到噬菌体,并采用双层平板法检测了噬菌体的效价、最佳感染复数(MOI)、一步生长曲线以及噬菌体对温度和酸碱度的敏感性。结果表明:从长期植烟田块土壤中分离得到1株青枯雷尔氏菌烈性噬菌体,命名为RS-PⅡ-1。经检测该噬菌体最佳感染复数为1;一步生长曲线显示噬菌体潜伏期为10 min,爆发期持续100 min,裂解量为1 411;该噬菌体40℃活性最高,裂解量也最大,当温度超过40℃时活性逐渐下降,直至在60℃时活性丧失;噬菌体对酸碱均具有一定的耐受能力,pH在4~8范围内噬菌体均有很好裂解活性,当p H小于4或大于8,裂解活性均减小,特别是在p H大于11时,噬菌体裂解活性完全丧失,因此噬菌体RS-PⅡ-1不适合与碱性溶液混合应用。

转群体感应淬灭基因attM烟草抗青枯病的研究

自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)克隆获得attM基因。采用叶盘转化法,农杆菌介导转化烟草,经过卡那霉素抗性筛选获得抗性愈伤组织,对其分化产生的植物株系进行PCR、PCR-Southern和荧光定量PCR及GUS染色检测分析。结果表明:attM基因被成功插入烟草基因组DNA中。在转基因株系中均能够表达,相对表达量最大可达125.8,最小为31.0。以野生型烟草和转pBI121空载体的烟草为对照,分别进行了离体及活体检测试验,结果表明:转attM基因烟草植株对茄科雷尔氏菌引起的青枯病抗性显著。1×107～1×108CFU.mL-1的青枯菌接种离体叶片,野生型烟草和转pBI121空载体的烟草的中毒面积与接种面积比值为15～25,转基因植株的比值低于3;青枯菌3×106CFU.mL-1伤根接种盆栽烟草植株14d,野生株和转空载体烟草均青枯死亡,病情指数为100,转基因植株病情指数为31.25。

青枯菌侵染后烟株体内过氧化物酶活性的变化及其与抗病性的关系

本实验分析了青枯菌侵染前后3个烤烟品种不同叶位的过氧化物酶(POD)活性变化,结果表明,烟株感染青枯病后,叶片POD活性呈上升趋势;在烟株未发病与发病的前中期,抗病品种各叶位的POD活性高于感病品种;在青枯病发病后期,抗感品种间的POD活性无明显差异。因此,POD活性的高低可作为品种对青枯病抗性鉴定的指标。