Mechanisms of Protein Synthesis in Chloroplasts:How to Design Translatable mRNAs in Chloroplasts

Chloroplast transformation provides a powerful tool to produce useful proteins in plants. After completion of the chloroplast genome sequencing from tobacco plants (Shinozaki et al., 1986, Yukawa et al., 2005), Pal

烟草叶绿体基因工程研究进展

叶绿体基因工程通过同源重组实现定点整合,与细胞核基因工程相比,使外源基因的表达更为高效和安全。叶绿体基因工程在模式植物烟草中的研究最为广泛。为此,总结了近年来烟草叶绿体基因工程在提高光合效率、抗性和品质等方面的研究进展,同时对利用该技术在生物反应器中生产生物质酶、次生代谢产物、疫苗和药用蛋白等方面进行了综述。在此基础上,对叶绿体基因工程的研究和应用前景进行了展望。

烟草叶绿体密码子的偏好性及聚类分析

综合运用多种软件对3种烟草属植物以及其他对照植物的6个叶绿体蛋白编码基因进行了分析。结果表明,普通烟草在密码子使用特性上与林生烟草最为接近,在所分析的59个密码子中,有39个密码子的RSCU(Relative Synonymous Codon Usage)值完全一样;8种参与分析的植物中共出现了30个具有偏好使用的密码子,其中7种双子叶植物在碱基组成上偏爱以C结尾的密码子,而水稻偏爱以T和C结尾的密码子;以RSCU值为基础的聚类结果显示出植物的密码子偏好性具有种族特征,表明基于叶绿体蛋白编码基因的密码子使用特性的聚类结果较适合用于系统发育分析的重要补充。

烟草叶绿体基因组和线粒体基因组SSR位点分析

利用生物信息学方法对烟草叶绿体和线粒体基因组数据中的SSR信息进行了分析。结果表明,在叶绿体和线粒体基因组中分别获得186和578个SSR位点,SSR间的平均距离分别为838bp和745bp。在SSR的分布区域上,绝大多数SSR位点分布在UTR(尤其是5′UTR)区域;在SSR重复碱基类型上,主要集中在二、三碱基重复,二者占总SSR位点的90%以上,其中三碱基重复类型丰度最高。利用全部657对SSR引物在供试的10份烟草材料中进行扩增,发现所有引物均能获得目的片段,但在普通烟草内品种间并未检测到多态性,而在烟草种间有26对叶绿体基因组SSR引物和178对线粒体基因组SSR引物扩增出多态性条带,表明来源于烟草叶绿体基因组和线粒体基因组的SSR标记适合用于烟草种间进化、分类、遗传多样性等方面研究。

施肥对烟草腺毛叶绿体形态结构的影响

以烤烟K326为材料,在盆栽条件下分别施用纯有机肥和无机肥,在烟株旺长期和成熟期对叶面腺毛进行显微和超微结构观察,以明确肥料对烟草叶面腺毛生长发育的影响,结果显示:移栽后50d,荧光下观察有机肥处理下腺头细胞叶绿素荧光强度较无机肥强烈,腺头细胞内叶绿体结构完整,类囊体基粒片层发达,嗜锇颗粒大而多;无机肥处理的细胞内叶绿体少,嗜锇颗粒较小,数量也较少.移栽后70d,有机肥处理腺毛头细胞叶绿体双层膜结构依然完整,但类囊体基粒片层结构已经解体,其中积累大量黑色嗜锇颗粒;此时无机肥处理腺毛头细胞叶绿体结构完整,仍可清晰看到类囊体基粒片层仅含少量嗜锇颗粒.推测有机肥处理在初期促进了烟草腺毛细胞叶绿体的发育和叶绿素的合成、积累,在后期,促进叶绿素及内膜系统的降解,并有利于亲脂类物质的合成和积累,从而对腺毛分泌物积累和烟叶香气品质形成具有积极影响.

烟草腺毛发育过程中叶绿体形态学研究

应用荧光显微技术和电镜技术,对不同发育时期烟草叶面腺毛的叶绿素荧光和叶绿体结构进行了比较研究.结果发现,在腺毛发育初期,腺头细胞叶绿素荧光明显,叶绿体类囊体结构清晰;随着腺头细胞的分裂和生长,叶绿素荧光逐渐增强,叶绿体数目逐渐增多,类囊体发达,嗜锇颗粒产生;在腺毛发育成熟以后,叶绿素荧光减弱,类囊体膜降解,嗜锇颗粒增多;随着腺毛的分泌活动增强,叶绿体完全降解,磷脂双层膜消失,嗜锇颗粒扩散到细胞质中,并最终聚集在细胞质膜附近.

拟南芥ats1A基因启动子的克隆和功能分析

通过PCR扩增,从拟南芥中克隆出ats1A基因启动子(包括叶绿体转运肽),将此启动子与GUS基因相连构建植物瞬时表达载体,用基因枪法将之导入烟草进行瞬时表达。GUS基因检测分析表明,ats1A基因启动子能特异的启动GUS基因在烟草叶片中高效表达。

烟草感染马铃薯Y病毒(PVY)后光合作用的变化规律

以马铃薯 Y病毒 ( PVY)为毒源 ,以烟草 NC89为材料 ,采取光合指标和超微结构相结合的研究方法 ,对感染 PVY烟草的叶绿素含量、光合速率等生理指标以及叶绿体结构变化的规律进行了研究 .结果表明 :在光照、温度、湿度、CO2 浓度和土壤水分都相对恒定的条件下 ,烟草 NC89感染马铃薯 Y病毒 ( PVY)后 ,烟草的叶绿素含量、光合速率、气孔导度、蒸腾速率都出现了不同程度的降低 ,而细胞间CO2 浓度有所升高 ,Hill反应的活性却明显下降 ,叶绿体超微结构受到明显的破坏 .

晾制期间白肋烟TN90叶绿体色素降解动态及呼吸强度的变化

通过田间试验,研究了晾制期间白肋烟TN90叶绿体色素的降解动态及呼吸强度、含水率、比叶重等的变化。结果表明,晾制期间TN90叶绿素(chl)、叶绿素a(chla)、叶绿素b(chlb)、类胡萝卜素等的含量均随叶位的升高而增加、随晾制进程的推进而下降,其降幅chla>chl>chlb>类胡萝卜素,下、中、上各叶位chla降幅最大的时段分别为0～6d、0～9d、0～12d,其余各类色素的降低幅度则比较平缓;chla/chlb及chl/类胡萝卜素的比值也随晾制进程的推进而下降,这有利于烟叶品质的改善。随着晾制过程中水分的散失,烟叶含水率逐渐下降,叶细胞生命活动也随之减弱,表现为呼吸强度和比叶重也随晾制进程及叶位下降而减小。

将IL-2基因构建到叶绿体转化载体并转入烟草

以人白细胞介素2（IL-2）基因为目的基因，烟草accD和ORF184同源序列为侧翼引导序列构建成烟草叶绿体转化载体pAIL。以火烟草NC89为转化受体，通过基因枪方法对烟草叶片进行轰击转化。轰击参数为：每枪0．6μm的金粉300～500μg，轰击距离6cm，真空度9．48×10^4Pa。在500mg/L的壮观霉素筛选眶下，经约30d的筛选分化，逐渐产牛绿色的抗壮观霉素芽或愈伤，目前已获得31株（丛）抗性芽及8块抗性愈伤。用IL-2基因的PCR引物对4株较大的小苗进行检测，初步证明3株为转基因植株。

烟叶生长发育过程中叶片光合特性及叶绿体超微结构的变化

在豫中烟区以NC89为材料研究烤烟叶片发育过程中光合特性及叶绿素含量的变化规律,并同步观察叶绿体超微结构的变化。结果表明:叶片发育过程中净光合速率值呈现先上升后下降的趋势,气孔导度、气孔限制值与净光合速率呈极显著相关关系,胞间CO2浓度与净光合速率呈显著负相关关系。叶绿素含量同净光合速率变化趋势一致,结合叶绿体超微结构观察结果,可知净光合速率的变化与叶绿体超微结构的发育及叶绿素含量密切相关,叶绿体结构逐步完善及叶绿素含量升高是导致净光合速率上升的主要原因,净光合速率下降的过程中,叶绿体超微结构的逐步解体,烤烟叶片的衰老主要是非气孔限制因素引起的。

转棉花叶绿体Cu/Zn-SOD基因烟草的获得及其功能的初步验证

构建了棉花叶绿体Cu/Zn-SOD基因的植物表达载体,利用农杆菌介导法将其导入NC89烟草,PCR、Southern blotting检测结果显示有4个烟草株系中整合了棉花叶绿体Cu/Zn-SOD基因,SOD酶活性测定结果显示4株转基因烟草植株SOD酶活性都明显高于非转基因烟草,离体叶片暗处理试验结果也证明四株转基因烟草比非转基因烟草SOD酶活下降速度明显减慢,百草枯喷施试验表明,转基因烟草都比非转基因烟草对百草枯的耐性增强,这一系列试验间接地说明外源基因的导入增强了烟草的耐衰老能力,本研究为今后利用SOD基因研究作物的早衰性状奠定了基础。

不同成熟度烤烟叶片主脉叶绿体的差异

以烤烟品种K326和G80中部叶为材料,分别在打顶前、欠熟、适熟、过熟阶段取样,用丙酮浸提法测定叶片主脉叶绿素含量;用石蜡切片法制片观察和测定叶片主脉基本组织细胞中的叶绿体数量,并动态记录茎叶夹角的变化.结果表明,叶片主脉叶绿素含量和叶绿体数量随着成熟度的提高而降低,叶绿体解体加快.K326和G80在茎叶夹角为50°左右时,处于适熟阶段.

移栽时间对烤烟光合特性、产量和品质的影响

为了明确潍坊烟区NC55品种适宜的移栽时间,试验设置了4个移栽时间处理(5月2日、5月12日、5月22日、6月1日),以调查移栽时间对烤烟生长发育、光合特性、叶绿素代谢酶活性、经济性状及感官评吸质量的影响。结果表明,移栽时间显著影响烤烟生长、光合特性和叶绿素代谢酶活性。与5月2日移栽相比,推迟移栽缩短了烤烟生长的伸根期、旺长期和采收期,从而缩短了大田生育期。随移栽时间推迟,旺长期、平顶期叶绿素含量和净光合速率显著提高,叶绿素酶和脱镁螯合酶活性显著降低,叶片长宽和单叶重增加;成熟期叶绿素含量和净光合速率显著降低,叶绿素酶和脱镁螯合酶活性显著提高;烟叶均价、上等烟叶比例和烟叶感官评吸质量呈先增加后降低趋势,以5月12日移栽最高,5月22日移栽次之。因此,建议生产上适当推迟移栽,潍坊烟区以5月12日前后移栽至5月22日结束为宜。

用气孔保卫细胞叶绿体计数法鉴定烟草染色体倍性方法初探

经不同浓度秋水仙碱液加倍处理的烟草花粉植株 ,用叶片气孔保卫细胞叶绿体计数法鉴定染色体倍性。研究表明 :气孔保卫细胞叶绿体数平均值差异极显著 ,单倍体 95 %以上的叶绿体数在 14个以下 ,双倍体 95 %以上的叶绿体数则在 14个以上。经开花结实验证其准确率达 91% ,且展开到第

不同品种白肋烟叶绿体色素及相关致香物差异研究

采用改进后的Arnon法及气相色谱一质谱联用技术，探索不同自肋烟品种叶绿体色素及相关致香物质的变化规律。结果表明，成熟时品种间叶绿素含量0．623—0．735mg／g，变异系数7．07％；类胡萝h素含量0．169—0．217mg／g，变异系数11．82％；叶绿素／类胡萝卜素比值2．887—4．336，变异系数18．0r7％；不同品种间叶绿素／类胡萝h素比值差异〉类胡萝卜素〉叶绿素。调制后品种间叶绿素裂解的产物含量148．12—230．01n，g／g，变异系数17．39％；类胡萝卜素类降解产物含量53．036—91．344mg／g，变异系数23．33％；品种间类胡萝卜素类降解产物含量差异〉叶绿素裂解的产物；综合结果，TN90、Kyg07品种成熟时叶绿素含量略低，但类胡萝卜素含量略高，叶绿素／类胡萝卜素低，比叶重较适宜，晾制后相应降解的致香物多，更有利烟叶香气品质的形成。

phaG和phaC基因在烟草叶绿体中的转化及其遗传分析

中长链羟基脂肪酸聚酯(medium-chain-length-PHAs,mcl-PHAs)属于微生物聚酯。羟酰-CoA-ACP-转移酶和II型PHA合酶是mcl-PHAs生物合成途径中的两个关键酶。将编码羟酰-CoA-ACP-转移酶的基因phaG与水稻叶绿体psbA基因的启动子和终止子连接构建表达盒RpsbA-pro-phaG-RpsbA-ter,将II型PHA合酶的基因phaC与水稻叶绿体16SrRNA基因的强启动子Prrn及rbcL基因的终止子连接构建表达盒prrn-phaC-RrbcL-ter,连同壮观霉素抗性基因aadA表达盒prrn-aadA-TpsbA-ter一起克隆进烟草叶绿体基因组同源片段rbcL和accD之间,得到烟草叶绿体表达载体pTGC。用包裹有质粒pTGC的金粉子弹轰击烟草无菌苗叶片,经壮观霉素筛选后获得6株叶绿体型转基因植株。对T0代和T1代转基因植株进行PCR检测和Southern blot分析表明,外源基因已整合进烟草叶绿体基因组中,且T1代转基因植株已同质化。RT-PCR分析结果证实外源基因已在转录水平上表达。转基因植株的自交及正反交结果表明,外源基因在转基因后代中能够稳定遗传,遗传方式遵循母性遗传规律,不存在转基因的花粉漂移现象。

有机肥和化肥对烟叶气体交换、叶绿素荧光特性及叶绿体超微结构的影响

【目的】本文以烤烟K326为材料,探讨了在不同叶龄时期有机肥与化肥在烟叶气体交换参数、叶绿素荧光特性、叶绿素含量及叶绿体超微结构等方面的差异,以期从光能利用(宏观)及叶绿体超微结构(微观)方面,揭示两种肥料配比对烟叶光合作用的影响机制,同时为探索烟叶高产优质栽培模式提供理论依据。【方法】以蛭石为栽培基质进行盆栽试验。设施用烤烟专用有机肥(N∶P2O5∶K2O为9∶9∶10,有机质≥70%,中、微量元素≥12%)和施用普通尿素两个处理。烟草为工厂化无毒育秧苗,叶龄(叶龄从叶片长约2 cm时算起)15天、30天、45天、60天和75天取样或测定自上而下第6~8片叶。用Li-6400(美国)便携式光合仪测定烟叶的净光合速率,蒸腾作用与气孔导度。使用M系列调制叶绿素荧光成像系统Maxi-Imaging-PAM(德国)测定叶绿素荧光参数。用C-7000透射电子显微镜观测叶绿体超微结构并拍照,用软件Auto CAD 2004计算淀粉颗粒在叶绿体中所占的相对面积比Ra,叶绿体基粒片层的统计方法据Goodenough等改进的Teichler-Zallen法。【结果】有机肥对烟叶叶绿素含量及光合速率的影响显著,在叶龄60天时,其叶绿素含量比普通化肥高136.1%;在叶龄75天时,其烟叶净光合速率、气孔导度及蒸腾速率分别比普通化肥处理高135.3%、84.5%和51.3%,叶绿素荧光参数Y[Ⅱ]和q L分别比普通化肥处理高22.2%和39.5%,Fv/Fm在叶龄60天时比普通化肥处理高18.7%,而NPQ值在叶龄45天时普通化肥比有机肥处理高23.3%。叶绿体内孕育的淀粉粒随叶龄的增加而逐渐膨大,期间伴随着淀粉粒在叶绿体中所占的面积比例(Ra值)越来越大,两处理Ra值差异明显,尤其是在叶龄45天时,化肥栽培下的烟叶Ra值比有机肥栽培高31.8%。有机肥处理的叶绿体呈梭形,长宽比大,而普通化肥种植的叶绿体形态近圆形,长宽比小。【结论】施用有机肥可显著提高烟叶叶绿素含量及光合速率,且随叶龄的增加,有机肥的作用效果日趋明显。叶绿素荧光参数的差异表明,增施生物有机肥可延缓烟株衰老、提高烟叶光能利用效率。两种施肥方式下,淀粉颗粒Ra值的差异不能说明施用化肥可提高烟叶合成淀粉的能力。与普通化肥处理下的烟叶相比,有机肥可显著提高叶绿体基粒垛叠数大于10的片层占基粒垛叠片层总数的百分比。

烟草花粉植株染色体倍性的早期快速鉴定

为了提高烟草单倍体育种效率，对用叶绿体计数法鉴定植株染色体倍性进行了研究。其结果是：以展开第５叶为材料，用植株气孔保卫细胞叶绿体数倍性分界法能早期、快速判定经秋水仙碱处理的烟草花粉植株是单倍体、二倍体或多倍体，其判定结果与开花结实情况有非常高的吻合率，且判定每株仅需１～２ｍｉｎ。

除草剂抗性基因bar导入烟草叶绿体

将编码Phosphinothricin acetyltransferase的bar基因与水稻叶绿体psbA基因的启动子和终止子构建成表达盒,连同烟草叶绿体基因组同源片段rpl2-trnH-psbA和trnK-ORF509A以及选择标记基因aadA一起构建成烟草叶绿体转化载体pTZBA.基因枪法转化烟草叶片,经壮观霉素筛选获得转化再生植株.分别以1.0kb的叶绿体同源片段trnK-ORF509A和0.6kb的bar基因为探针,对转基因烟草叶绿体DNA进行Southern杂交检测,证明外源基因已整合入烟草叶绿体基因组中.抗性试验表明,转基因植株具备除草剂(PPT)抗性.