一种新的产生天然蛋白的不依赖于连接的克隆载体

报道一种新的不依赖于连接的克隆(LIC)载体.该载体被缺刻的内切酶N.BbvCIA和限制性内切酶SwaⅠ作用产生长的粘性末端.靶向基因的PCR片段在4 mmol/L dGTP的孵育下被T4 DNA聚合酶处理生成互补粘性末端.将处理过的载体和PCR产物共转化到大肠杆菌体内,插入载体的接合能够被宿主酶和给定的重组质粒修复.接着引入到大肠杆菌表达系统,该融合蛋白能够被表达和纯化,再用烟草蚀刻病毒TEV蛋白酶处理将移去靶蛋白的N末端,产生天然蛋白.两个基因,绿色荧光蛋白基因egfp和硫氧环蛋白基因txn已被用于这个系统.结果表明LIC策略对于高通量克隆和表达是高效的,对于天然蛋白的产生也同样高效.

抗自溶烟草蚀纹病毒蛋白酶的原核表达和纯化及活性分析

利用QuikChangeSite-Directed Mutagenesis Kit将自溶性烟草蚀纹病毒蛋白酶(tobacco etch virus Protease,TEVP)219位的Ser(S)突变为Val(V),经测序验证的S219V突变质粒pMAL-TEVPS219V电转化大肠杆菌BL21Star(DE3),并优化异丙基硫代β-D半乳糖苷(IPTG)诱导浓度、温度、时间对TEVP表达的影响。结果表明,突变的TEVP表达最适条件为24℃,0.75mmol/L IPTG诱导11h。经金属离子螯合层析纯化得到高纯度,高活性的突变TEVP蛋白酶,比活力为1 048U/mg。每升菌液可纯化17.2mg目标蛋白。

采用TEV酶法进行整合膜蛋白拓扑学分析

为了研究膜蛋白的跨膜结构,进行拓扑学分析是十分重要的.有许多分析膜蛋白拓扑结构的方法,本文采用烟草蚀斑病毒(TEV)酶特异性切割测试蛋白中跨膜片段的前段或后端所插入的tev识别序列EXXYXQ(S/G),如果TEV酶能够切割,表明该序列位于目标蛋白的细胞质外.将Tev识别序列ENLYFQG分别插入到拟南芥整合膜蛋白的的跨膜区域,然后转化进入酿酒酵母中.消解酶(zymolyase)酶破除酵母的细胞壁后,TEV酶消化球状体,最后通过Western免疫印迹法来分析结果.有关该方法的注意事项在结果中进行了讨论.

钴离子对烟草蚀纹病毒蛋白酶结构的影响

烟草蚀纹病毒蛋白酶(Tobacco Etch Virus protease,TEVp)是一种高特异性、高保守的重要工程蛋白,其结构稳定性尤为重要;钴离子(Co^(2+))具有一定的生物毒性.为了解Co^(2+)对TEVp结构的影响,运用内源荧光方法和同步荧光方法探讨Co^(2+)对TEVp结构的调控机理.光谱显示Co^(2+)对TEVp内源荧光有明显的淬灭作用,导致TEVp分子中色氨酸和酪氨酸残基的疏水性增加.在300 K和311 K温度条件下,淬灭常数K_(sv)分别为4.161×10~2L/mol和2.129×10~2L/mol,结合平衡常数K_A分别为6.625×10~3L/mol和5.132×10~3L/mol,且动态荧光淬灭速率常数Kq远大于扩散碰撞淬灭速率常数的最大值2.0×10^(10)L mol^(-1)s^(-1),表明其淬灭机制属于静态淬灭.吉布斯自由能ΔG<0,焓值ΔH<0且熵值ΔS>0,表明Co^(2+)与TEVp的相互作用能够自发进行,且它们之间的主要作用力类型为静电作用力.本研究分析Co^(2+)对TEVp多种荧光光谱性质的影响和Co^(2+)对TEVp结构影响的作用机制,可为TEVp在生物学和生物工程等领域的有效利用奠定基础.