嗜水气单胞菌外膜蛋白TolB的原核表达及生物信息学分析

为筛选TolB作为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)渔用疫苗候选抗原,从嗜水气单胞菌中克隆了外膜蛋白tolB基因并异源表达,采用生物信息学方法预测TolB的理化性质和结构特征。结果显示,tolB基因片段(去除信号肽)全长1 263 bp,编码1条含有420个氨基酸残基的多肽,分子质量45.78 ku。成功在大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中异源表达TolB蛋白,其为稳定的亲水性外膜蛋白。TolB蛋白家族在不同菌株间具有同源性,尤其在气单胞菌间亲缘关系更近。TolB蛋白二级结构以无规则卷曲为主,具有潜在的B细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和辅助T细胞(Th)抗原表位;相互作用网络主要为TolPal系统蛋白。综上,TolB具有成为嗜水气单胞菌亚单位疫苗有效候选抗原的特性。

溶藻弧菌HY9901转运蛋白TolB的原核表达及条件优化和纯化

为研究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HY9901转运蛋白TolB作为疫苗候选抗原的可能性,根据已发表的溶藻弧菌HY9901转运蛋白TolB序列(JQ846501),设计1对带酶切位点的引物,PCR扩增tolB基因,然后经酶切、连接等步骤,构建tolB基因的原核表达载体pET-TolB,并对其IPTG浓度、诱导时间、温度、洗脱浓度进行优化,以期获得较大量的目的蛋白。结果表明:IPTG诱导后经SDS-PAGE与Western-blot分析,成功表达了溶藻弧菌HY9901株TolB蛋白,分子量与预期相符,且表达的蛋白以包涵体的形式存在;TolB蛋白在大肠杆菌中诱导表达的优化条件为:0.2mmol/L IPTG,37℃诱导4h;最佳咪唑洗脱浓度为400mmol/L。这些结果为进一步研究目的蛋白的免疫原性和疫苗制备奠定基础。

溶藻弧菌转运蛋白TolB的免疫原性与免疫保护性

旨在研究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HY9901转运蛋白Tol B作为疫苗候选抗原的可能性,根据已发表的全基因组序列,设计特异性引物PCR扩增tol B的基因全长序列。序列分析显示,该基因(Gen Bank登录号JQ846501)全长1 353 bp,共编码450个氨基酸残基。BLAST分析发现,溶藻弧菌tol B基因与其他已知弧菌的tol B具有较高的同源性,序列保守,可作为共同抗原候选蛋白。用原核表达的tol B蛋白免疫SPF级小鼠,制备多克隆抗体,ELISA效价达1∶40 000。免疫印迹表明鼠抗tol B血清能与诱导后的重组蛋白发生特异反应。为进一步研究tol B对石斑鱼(Epinephelus awoara)的免疫保护性,用Tol B蛋白两次免疫石斑鱼,ELISA检测发现,免疫石斑鱼血清的抗体效价在第4周达到峰值(1∶2 048)。攻毒实验结果表明Tol B对石斑鱼的免疫保护率为76%。结果表明,溶藻弧菌转运蛋白Tol B具有较好的免疫原性和免疫保护性,可作为弧菌亚单位疫苗的候选抗原。

溶藻弧菌TolB蛋白的生物信息学分析

对溶藻弧菌转运蛋白(TolB)进行结构和功能进行分析,设计其表位多肽重组疫苗,以提高溶藻弧菌TolB蛋白的免疫效果,运用生物信息学方法对溶藻弧菌TolB蛋白的系统进化关系、理化性质、高级结构和细胞抗原表位进行分析。进化关系结果显示,溶藻弧菌的TolB蛋白与副溶血性弧菌、霍乱弧菌和费氏弧菌的TolB蛋白具有较高同源性,溶藻弧菌TolB蛋白可能对这4种菌株的感染起到交叉免疫保护作用。溶藻弧菌TolB蛋白为亲水性蛋白,1—22位氨基酸为其信号肽位置,无跨膜结构并定位于细胞膜外;溶藻弧菌TolB蛋白二级结构中以无规则卷曲(40.00%)、α-螺旋(18.67%)和β-转角(11.33%)为主。溶藻弧菌TolB蛋白可能存在4个优势B细胞抗原表位,1个细胞毒性T淋巴细胞(CTL)抗原表位,1个辅助T细胞(Th)抗原表位,并重组拼接获得抗原性较好的TolB蛋白表位多肽。

tolB和tolR基因缺失对鼠伤寒沙门菌生物学功能的影响

Tol-Pal系统是一种由TolQ、TolR、TolA、TolB和Pal五种包膜蛋白组成的多蛋白复合体,在维持革兰氏阴性菌外膜完整性方面发挥关键作用。这些蛋白质首先在大肠杆菌中被发现,随后在很多其他细菌属中被鉴定到,但Tol-Pal系统在鼠伤寒沙门菌(Salm onella Typhimurium)中的作用尚不十分清楚。本研究评估了Tol-Pal系统中的TolB和TolR蛋白在鼠伤寒沙门菌χ3761表型和生物学中的作用。结果显示,tol B和tolR缺失株显著降低了χ3761的运动能力,tolB和tolR缺失株菌体呈现球形和长链状,此外还发现菌体表面存在鞭毛缺失和囊泡凸起的微观变化,证实tolB和tolR的缺失对细胞壁造成了严重的破坏。结果表明,tolB和tolR缺失株均显著降低了鼠伤寒沙门菌在脱氧胆酸钠作用下的存活率,并对万古霉素表现出高度敏感性,这可能是由于包膜完整性受到破坏所致。进一步的研究表明,tolB和tolR基因均参与外膜囊泡(OMVs)的产生。综上所述,这项研究扩展了我们对鼠伤寒沙门菌Tol-Pal系统生物学功能的认识。