以大肠埃希菌tolC蛋白为靶标的适配体的筛选及结构分析

目的:筛选大肠埃希菌外排泵tolC蛋白的核酸适配体。方法:重组表达大肠埃希菌外排泵外膜蛋白tolC,利用指数富集的配体系统进化技术(stematic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)从单链DNA文库中筛选出一组能够特异性与其结合的核酸适配体。利用FITC荧光素标记技术检测每轮单链DNA文库与靶蛋白的亲和力,直至亲和力的上升趋于饱和,将最后一轮筛选产物克隆测序,并用DNAman软件分析其二级结构。结果:经过12轮筛选,单链DNA文库与靶标蛋白的亲和力趋向稳定,将第12轮筛选产物克隆测序,对获得的23个适配体进行分析。一级结构分析显示23个适配体并无共同的保守序列,但分别有3对和2对适配体序列完全一致。二级结构预测分析表明,茎环结构为适配体主要的结构形式,提示其可能是适配体与tolC蛋白蛋白特异性结合的基础。根据二级结构特点可将23个适配体分为4个家族,其中20号适配体与靶标蛋白亲和力最高。结论:成功利用SELEX技术筛选获得了特异结合tolC的高亲和力的核酸适配体,为大肠埃希菌耐药干预及机制研究奠定了基础。

鱼类致病嗜水气单胞菌外膜蛋白TolC的原核表达及抗原性分析

探究鱼类致病嗜水气单胞菌外膜蛋白TolC的免疫原性与抗原性,评价其免疫学功能,以期为嗜水气单胞菌亚单位疫苗的开发提供理论依据。采用生物信息学方法预测TolC蛋白的理化性质,分析其菌属间同源性与进化关系,构建TolC蛋白表达菌株并确定其最佳诱导表达条件,包涵体洗涤和SDS-PAGE电泳切胶纯化TolC蛋白,免疫小鼠制备TolC抗血清,Western blot检测抗血清特异性与效价,免疫酶联法模拟TolC蛋白抗血清对不同鱼类致病菌的体外识别,探究TolC蛋白的抗原性。结果表明,TolC蛋白为孔道蛋白,在气单胞菌属间进化保守。成功表达、纯化了TolC蛋白,其最佳表达条件:菌液OD 600为1.0、IPTG浓度0.1 mmol/L、37℃诱导8 h。Western blot结果表明,制备获得特异性TolC抗血清,效价达到1∶3200;ELISA结果显示,TolC抗血清与嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、溶藻弧菌均存在识别作用。综上,嗜水气单胞菌外膜蛋白TolC具有较好的免疫原性和抗原性,并可能对不同鱼类致病菌存在交叉免疫保护作用。

氟喹诺酮体外诱导肺炎克雷伯菌外排蛋白表达差异的研究

目的探讨氟喹诺酮体外诱导肺炎克雷伯菌外排蛋白表达的差异。方法取临床分离对喹诺酮敏感的肺炎克雷伯菌20株,分2组,每组10株,1组作对照组,观察组将应用不同浓度梯度环丙沙星逐级诱导,最后成为耐药株,观察2组细菌在不同浓度抗生素应用后的差异,并比较观察组的10株敏感菌和诱导后耐药菌在应用外排泵抑制剂前后最低抑菌浓度(MIC)及SDS-PAGE电泳外排泵膜蛋白表达的差异。结果环丙沙星从小至大剂量体外诱导出高度耐药株的出现,其53KDa外膜蛋白TolC表达增多。应用外排泵抑制剂利血平后,70%诱导耐药菌MIC有明显下降。结论喹诺酮体外诱导可使肺炎克雷伯菌的耐药性出现,TolC表达增多表明外排泵在肺炎克雷伯菌耐药机制中起重要作用。外排泵抑制剂的应用对肺炎克雷伯菌耐药有一定的遏制作用。

环介导等温扩增联合横向流动试纸条快速检测创伤弧菌检测方法的建立

环介导等温扩增技术(LAMP)与横向流动试纸条(LFD)检测联合应用,建立了一种新的快速、便捷的创伤弧菌检测方法。针对创伤弧菌的外膜蛋白TolC基因设计6条特异性引物和1条异硫氰酸荧光素(FITC)标记的探针。生物素标记的LAMP扩增产物能够特异性地与FITC标记的探针杂交,杂交产物经LFD检测。优化后的扩增温度和时间为63℃反应35 min,加上细菌基因组DNA提取步骤,完成检测仅需要80 min。LAMP-LFD方法可特异性地检出创伤弧菌,对哈维氏弧菌等9种水产品常见病原菌的检测均呈阴性;对纯细菌培养物的检测灵敏度为3.7×102 CFU/mL或7.4 CFU/反应,是利用外引物建立的常规PCR检测的100倍。结果表明,该方法能够准确、快速、灵敏地检出创伤弧菌,可应用于创伤弧菌污染的水产品的检测。