bcr/abl融合蛋白对细胞DNA损伤修复功能的影响

目的:建立稳定表达bcr/ablP210融合蛋白的小鼠转化细胞株BaF3-P210的DNA损伤模型,探讨bcr/abl融合蛋白对细胞DNA损伤修复功能的影响.方法:彗星实验检测不同浓度H2O2诱导的BaF3-P210细胞的DNA损伤建立DNA损伤模型,以空载体转染BaF3-MIGR1细胞为对照;用彗星实验对两组细胞在DNA损伤后的修复进行不同时间段的动态观测.结果:彗星实验确定了细胞DNA损伤模型的建立条件是:采用50μmol/L终浓度的H2O2对BaF3-MIGR1细胞和BaF3-P210细胞进行染毒,H2O2作用温度和时间均为4℃,10min.BaF3-P210细胞与BaF3-MIGR1细胞相比DNA损伤后修复时间缩短,在损伤后60min即可达到完全修复,而后者在损伤后120min才能完全修复(P<0.05).结论:建立了表达bcr/ablP210融合蛋白的小鼠转化细胞株BaF3-P210细胞的DNA损伤模型,并发现bcr/abl融合蛋白可增强BaF3-P210细胞的DNA损伤后修复能力.

抑制Polo样激酶1表达靶向DNA错配修复相关通路并抑制卵巢癌的相关研究

目的:观察Polo样激酶1(PLK1)在卵巢癌(OC)细胞和组织中的表达情况,以及抑制PLK1表达对耐5-氟尿嘧啶(5-FU)的OC细胞活力和凋亡的影响。方法:在2011年4月~2018年12月的126名OC患者纳入本研究。采用免疫组化法检测PLK1在OC组织及邻近正常卵巢组织中的表达水平。体外构建耐5-FU的OC细胞系(OVCAR3-5FU_(res)和SKOV3-FU_(res))。将PLK1重组质粒和PLK1-sh RNA慢病毒载体(sh-PLK1)分别转染到OVCAR3、SKOV3、OVCAR3-5FU_(res)和SKOV3-5FU_(res)细胞中。采用CCK-8法检测细胞活力;通过串联亲和纯化和质谱分析确定PLK1在OC细胞中的结合蛋白;流式细胞术检测细胞凋亡。结果:在OC细胞系中,PLK1水平显著上调(P<0.05);并且在大多数OC组织中,PLK1表达较癌旁组织显著上调(P<0.05)。Kaplan-Meier分析显示,PLK1高表达OC患者的平均存活时间显著短于PLK1低表达OC患者(P<0.001)。OC中PLK1水平的升高与FIGO分期、肿瘤分级和错配修复缺陷等临床病理特征显著相关(P<0.05)。与阴性对照细胞相比,转染sh-PLK1的细胞活力显著降低(P<0.05);而转染PLK1重组质粒的OVCAR3和SKOV3细胞的活力显著高于对照细胞。通过串联亲和纯化和质谱分析确定人Mut S蛋白同系物2(hMSH2)是PLK1在OC细胞中的结合蛋白,并且h MSH2基因敲除使sh-PLK1转染的OVCAR3-5FU_(res)细胞的凋亡率降低(P<0.01)。结论:抑制PLK1表达通过靶向h MSH2提高了OC细胞对5-FU的敏感性。

顺铂对bcr/abl转化BaF3-P210细胞DNA损伤与修复能力的影响

目的:研究顺铂(cisplatin,Cis)对白血病BaF3-MIGR1细胞和bcr/abl转化BaF3-P210细胞中DNA损伤修复能力的影响。方法:锥虫蓝染色法检测2种细胞经0.5、1、5、10、20和40μg/mL Cis处理0、2、4、6、8、12、24和48 h时的存活率,免疫荧光法检测上述6种浓度Cis处理细胞8 h后诱导的γH2AX焦点数,Western印迹法检测DNA修复0、4、12和24 h后的γH2AX蛋白表达情况。结果:随着Cis处理时间和剂量增加,2种细胞的存活率降低,BaF3-P210转化细胞的存活率比BaF3-MIGR1细胞高(P<0.05);随着Cis剂量上升,2种细胞的γH2AX焦点数上升,BaF3-P210转化细胞的焦点数比BaF3-MIGR1细胞少(P<0.05);随着DNA修复时间延长,2种细胞的γH2AX蛋白表达均下调,BaF3-P210转化细胞的γH2AX蛋白表达量比BaF3-MIGR1细胞低。结论:Cis对BaF3-MIGR1细胞和BaF3-P210转化细胞的损伤呈时间、剂量效应,2种细胞的γH2AX焦点数与损伤之间存在剂量效应,bcr/abl可增强BaF3-P210转化细胞的DNA修复能力。

miR-23a通过调控DNA错配修复蛋白MLH1、MSH2对子宫内膜样癌进展的影响及机制研究

目的 探讨微小RNA-23a(miR-23a)在子宫内膜样癌细胞进展中的作用及其可能的分子机制。方法 RT-qPCR实验和免疫组织化学染色分别检测子宫内膜样癌组和癌旁组织中miR-23a、Mut L同源物1(MLH1)和MutS蛋白同系物2(MSH2)的mRNA和蛋白表达。体外培养人子宫内膜样癌细胞株Ishikawa细胞,将细胞分为正常组、miR-23a inhibitor转染组以及miR-23a mimic转染组,RT-qPCR实验检测Ishikawa细胞中miR-23a、MLH1和MSH2的mRNA水平,CCK-8法检测细胞增殖能力,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力,Western blot检测细胞中MLH1、MSH2蛋白的表达。结果 子宫内膜样癌组织中miR-23a相对表达水平较癌旁组织显著升高,MLH1和MSH2 mRNA和蛋白表达水平较癌旁组织显著降低(P<0.05)。miR-23 ainhibitor转染组Ishikawa细胞中miR-23a的表达、细胞增殖、迁移和侵袭能力较正常组均显著降低(P<0.05),miR-23a inhibitor转染组Ishikawa细胞中MLH1、MSH2的mRNA与蛋白水平较正常组均显著升高(P<0.05)。miR-23 amimic转染组Ishikawa细胞中miR-23a的表达、细胞增殖、迁移和侵袭能力较正常组均显著升高(P<0.05),miR-23a mimic转染组Ishikawa细胞中MLH1、MSH2的mRNA和蛋白水平较正常组均显著降低(P<0.05)。结论 miR-23a可能通过调控MLH1、MSH2的表达促进子宫内膜样癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

TONSL在食管癌中的表达及其影响食管鳞癌细胞增殖的机制

目的:探讨tonsoku样DNA修复蛋白(TONSL)在食管癌组织中的表达及其对食管鳞癌细胞增殖的影响及机制。方法:利用cBioPortal、GEPIA和PRIDE等数据库分析在食管癌组织中,TONSL基因组拷贝数及其转录和翻译水平的变化。通过免疫组织化学实验检测TONSL蛋白在食管鳞癌和正常食管组织中的表达。利用siRNA干扰构建TONSL瞬时敲降食管鳞癌细胞模型,并采用集落形成实验和EdU实验检测TONSL敲降对食管鳞癌细胞增殖能力的影响。Western blot检测TONSL敲降后食管鳞癌细胞中DNA损伤修复相关标志蛋白ATM丝氨酸/苏氨酸激酶(ATM)和检查点激酶2(CHK2)及其磷酸化激活水平的变化。结果:与正常食管组织比较,食管癌基因组、转录组和蛋白质组的数据库分析结果显示,TONSL在食管癌组织中拷贝数增加表达,其mRNA和蛋白质表达水平在食管癌组织中均上调(P<0.05),且TONSL高表达与食管癌患者不良预后相关(P<0.05);免疫组织化学验证结果也表明TONSL蛋白在食管鳞癌组织中表达上调(P<0.001)。集落形成实验和EdU实验结果显示,与对照组相比,TONSL敲降后食管鳞癌细胞增殖能力减弱(P<0.05),并且在敲降TONSL后,食管鳞癌细胞DNA损伤修复相关蛋白ATM和CHK2的磷酸化水平均上调(均为P<0.05)。结论:TONSL在食管鳞癌中表达上调,并通过参与食管鳞癌细胞DNA损伤修复促进食管鳞癌细胞增殖。

SUMO化修饰在DNA双链断裂修复中的研究进展

小泛素样修饰蛋白(SUMO)是一种与泛素结构类似的蛋白,其主要参与蛋白的翻译后修饰.SUMO化是指SUMO通过泛素样特异性蛋白酶1(Ulp1)、E1激活酶、E2结合酶和E3连接酶,使自身经历成熟、激活、结合和连接4个步骤最终共价结合至靶蛋白的特定赖氨酸位点上,使靶蛋白活性发生改变,进而参与调节多种细胞功能,如转录调控、胚胎发育调节、细胞应激、维持染色质结构及基因组稳定性等.近年来发现SUMO化修饰也广泛参与DNA的损伤修复,尤其是DNA损伤类型最为严重的DNA双链断裂(DSBs),SUMO几乎参与了其修复的全过程,因此SUMO化修饰在DNA损伤修复中的作用已成为研究热点.对近年来SUMO化修饰调控DSBs修复的研究进展作一综述.