间充质干细胞在小型猪重组牙胚同种异体移植中的免疫调节作用

目的 探索在小型猪重组牙胚同种异体移植实现颌骨内牙再生过程中,间充质干细胞BMMSCs的免疫调节作用。方法 将胚胎小型猪帽状期牙胚解离重组后,移植至成年小型猪拔牙区,BMMSCs经分离鉴定后,单独或与他克莫司FK506联合应用,进行同种异体移植免疫干预;评估受体小型猪的免疫状况和牙再生小型猪百分比。结果 BMMSC组受体小型猪CD3^(+)细胞和CD3^(+)CD8^(+)细胞比例均显著下降(P<0.05),Tregs细胞比例显著上调(P<0.05),有牙再生的小型猪百分比为75%;而BMMSC^(+)FK506组CD3^(+)和CD8^(+)T细胞比例均显著下调(P<0.05),但Tregs比例与空白对照组无显著差异,该组25%小型猪有牙再生;空白对照组的免疫排斥相关指标上调,未发现牙再生。结论 相对于与FK506合用,单独使用BMMSCs更有利于同种异体重组牙胚移植。

体外成牙环境对牙髓干细胞和外胚间充质干细胞分化的影响

目的利用牙胚细胞(TGC)作为诱导成牙环境,将牙髓干细胞(DPSC)、外胚间充质干细胞(EMSC)分别与其共培养,观察DPSC和EMSC的分化能力。方法利用出生后4 d的大鼠TGC作为诱导成牙环境,将培养的DPSC、EMSC使用BrdU标记及鉴定后与其共培养,免疫荧光双标检测标记细胞表面抗原牙本质涎蛋白(DSP)的表达和碱性磷酸酶(ALP)活性的变化,免疫组化染色鉴定及图像分析DPSC、EMSC在成牙环境中的分化能力。结果共培养7 d后,EMSC共培养组DSP阳性细胞的转化率高于DPSC共培养组(P<0.05)。免疫组化染色图像分析结果表明共培养7 d后,共培养组与TGC单独培养组差异显著(P<0.05)。共培养组3、7 d后ALP活性明显增高,EMSC共培养组较DPSC共培养组ALP活性高。结论混合培养的TGC作为诱导细胞分化的微环境与DPSC、EMSC共培养后,能够诱导细胞向成牙本质细胞分化,EMSC分化能力高于DPSC。

脂肪来源干细胞诱导分化为成牙本质样细胞的体外培养研究

目的:探讨大鼠脂肪来源干细胞(ADSCs)向成牙本质样细胞分化的可能性。方法:SD仔4只,处死后取腹股沟处脂肪组织。采用细胞体外共培养的方法,在牙胚细胞条件培养液(TGC-CM)的诱导下,通过形态学观察、免疫组化、RT-PCR等方法,观察脂肪来源干细胞向成牙本质样细胞分化的过程。结果:大鼠脂肪来源干细胞在诱导培养基中生长良好。培养7d,在诱导组中细胞出现核极化,有很长的突起,细胞平行排列。抗牙本质涎蛋白(DSP)呈阳性反应。RT-PCR显示mRNA水平表达成牙本质细胞特异的牙本质涎磷蛋白(DSPP)和牙本质基质蛋白(DMP-1)。结论:含有多种细胞因子的TGC-CM能提供较好的微环境,诱导大鼠脂肪来源干细胞向成牙本质样细胞分化,能为组织工程牙体再生提供种子细胞来源和微环境选择。

bFGF/BMP-2转染大鼠骨髓干细胞体内成牙的研究

目的:牙胚细胞和成纤维生长因子(Fibroblast growth factor bFGF)/骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2BMP-2)联合转染的骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)混合培养,复合明胶海绵支架构建牙组织工程植入大鼠体内,探究其成牙能力。方法:取健康SD大鼠128只,随机分为4组:细胞团块组;明胶海绵组;细胞团块+明胶海绵组;空白对照组,不做任何干预,均在全麻下植入大鼠肾被膜下。术后按4个时间点(5、10、14、28d各8只)分期取材,进行大体组织观察,Masson染色和免疫组化染色。结果:大体组织和Masson染色:术后5、10、14、28d形态学观察显示细胞团块+明胶海绵组形成牙样组织。免疫组化:析因分析显示细胞团块+明胶海绵组在5、10、14dDMP-1、BMP-4、DSP表达量最高且均高于其余各组,随着时间推移表达量逐渐有减小趋势,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:牙胚细胞和基因转染BMSCs混合培养,复合明胶海绵构建牙组织工程的体内实验结果形成牙样组织,为组织工程牙的成功构建奠定了一定的基础。

牙齿发育中程序性细胞死亡的研究

目的：阐明程序性细胞死亡在牙齿发生、发育过程中的意义。方法：采用原位末端标记法（ＴＵＮＥＬ法）及ＨＥ染色技术，对纯系ＳＤ大鼠牙胚发育不同阶段的程序性细胞死亡现象进行观察。结果：在牙齿发育的蕾状期、帽状期、钟状期均有程序性细胞死亡现象。蕾状期主要出现在上皮细胞增殖内陷形成的蕾状突起的顶端，帽状期、钟状早期集中出现在细胞增殖生长中心（原发性釉结节，颈环）处，钟状晚期及牙体组织形成后成釉器星网层及牙乳头细胞中多见，外釉上皮及已分化的成釉细胞、成牙本质细胞中散在。结论：在牙齿发育形成过程中，程序性细胞死亡参与上皮－间充质相互作用。控制着不同状态下细胞增生的数量，及时清除多余细胞，完成其对牙齿发育的重要塑形作用。

不同直径牙胚细胞增殖和骨向分化能力的评估

目的:比较大鼠不同直径牙胚细胞增殖和骨向分化能力的差异。方法:酶消化法分离、培养SD大鼠牙胚细胞,经13μm标准细胞筛分选后获得大、小2种直径的细胞;并分别采用MTT法检测2种细胞的增殖能力;碱性磷酸酶(ALP)试剂盒、茜素红染色法及qRT-PCR检测两者的骨向分化能力。结果:小细胞的增殖能力较低(P<0.05);培养3、7 d后,小细胞组的ALP活性均明显高于大细胞组(P<0.05);培养14 d后,小细胞组钙化结节数量明显高于大细胞组;qRT-PCR检测结果显示,小细胞组中Ocn、Osx、Runx2各矿化相关基因的表达水平均明显高于大细胞组(P<0.05)。结论:牙胚细胞中直径小于13μm的细胞比直径大于13μm的细胞增殖活性低,分化能力强。

混合信号诱导的大鼠骨髓间充质干细胞与支架材料复合成牙的体内研究

目的:研究经碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)与骨形态发生蛋白2(BMP-2)混合信号诱导的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在体内环境中与不同支架材料复合后的成牙潜能。方法:将取自SD大鼠的BMSCs与牙胚细胞在bFGF和BMP-2混合信号诱导的微环境中共培养后分别接种于明胶海绵和3D打印的PVA/DCCP复合支架材料上,然后回植入同种异体大鼠肾被膜下。在回植后的第1、3、7、14、28天采集回植体样本,用实时定量PCR(RT-PCR)检测各组样本成牙相关基因成釉蛋白(AMBN)、牙本质基质蛋白1(DMP1)、Ⅰ型胶原蛋白(Collagen-Ⅰ)、以及同源异型盒基因1(DLX1)mRNA水平。结果:各基因在不同时间点的表达量与完整牙胚(E组)均存在统计学差异(P<0.05);上述4个成牙相关基因的表达水平在不同支架材料组之间具有显著性差异(P<0.001);不同成牙诱导信号对各个基因的表达水平也有一定影响。结论:在体内模拟环境下,经bFGF与BMP-2混合信号诱导的大鼠BMSCs与3D打印支架材料复合后能提高成牙基因的表达水平,促进牙体组织的形成。优选支架材料并构建合适的组织工程牙模型对实现非牙胚源性细胞向牙源性细胞的转化同样具有重要意义。

牙胚细胞条件培养液诱导大鼠胚胎面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化

目的:探讨牙胚细胞条件培养液(TGC-CM)在诱导面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化中的作用。方法:取妊娠12.5dSD大鼠胎鼠第4代下颌突外胚间充质细胞,在牙胚细胞条件培养液(TGC-CM)的诱导下,通过形态学观察、免疫组化、RT-PCR等方法,探索牙胚细胞条件培养液诱导面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化的可能。结果:面突外胚间充质细胞在诱导培养基中生长良好。培养7d,在诱导组中细胞出现核极化,有很长的突起,细胞平行排列。抗牙本质涎蛋白(DSP)呈阳性反应。RT-PCR显示mRNA水平表达成牙本质细胞特异的牙本质涎磷蛋白(DSPP)和牙本质基质蛋白-1(DMP-1)。结论:面突外胚间充质细胞在含有多种细胞因子的TGC-CM的作用下能分化为成牙本质样细胞,能为研究牙齿的分化和发育提供良好的模型和实验依据。

胎盘间充质干细胞牙向分化的体外研究

目的探讨胎盘间充质干细胞牙向分化的可能性。方法双酶(胶原酶和胰蛋白酶)消化法获得SD大鼠胎盘间充质干细胞,免疫细胞化学鉴定其表型、成脂成骨诱导鉴定其多向分化能力。SD大鼠胎鼠牙胚细胞条件培养基诱导胎盘间充质干细胞14 d,免疫细胞化学检测DSP和DMP-1,RT-PCR及凝胶电泳检测DSPP和DMP-1基因。结果胎盘间充质干细胞表达CD29、CD44和CD105,而不表达CD31、C34和CD45。成骨和成脂诱导后形成钙结节以及脂滴。牙向诱导后的胎盘间充质干细胞形态无明显改变,表达成牙本质细胞特异性相关蛋白-DMP-1、DSP和特异性基因-DMP-1和DSPP。结论胎盘间充质干细胞具有牙向分化的潜能。

细胞极性相关蛋白CDC42和PAR3在小鼠牙胚发育过程中的表达

目的:研究细胞极性相关蛋白CDC42和PAR3在小鼠牙胚发育过程中的表达,探讨其在牙胚发育中的可能作用。方法:取13.5、14.5、16.5和18.5d(E13.5、E14.5、E16.5和E18.5)的小鼠胚胎以及出生后1和5d(PN1和PN5)的小鼠,分离头部,固定、脱钙、脱水、石蜡包埋、切片,HE染色观察牙胚的组织形态表现,采用免疫组织化学染色方法观察CDC42及PAR3在牙胚发育过程中的表达。结果:HE染色观察,E13.5~E18.5分别为小鼠牙胚发育的蕾状期、帽状期、钟状早期和钟状晚期,PN1小鼠的牙胚中可见分化成熟的成牙本质细胞和成釉细胞,PN5小鼠牙胚可见牙冠部发育完成。免疫组织化学染色,CDC42在E13.5、E14.5和E16.5小鼠牙胚中有广泛表达,在E18.5小鼠牙胚中表达较E13.5、E14.5和E16.5减少,在PN1和PN5小鼠牙胚中主要表达于成牙本质细胞和成釉细胞的分泌端;PAR3弱表达于E13.5和E14.5小鼠牙胚,在E16.5和E18.5小鼠牙胚上皮处表达明显增强,在PN1和PN5小鼠牙胚中表达较E18.5减弱。结论:CDC42和PAR3参与小鼠牙发育的过程,在牙胚发育早期可能参与小鼠牙胚的增殖及迁移,在牙胚发育晚期可能参与了成牙本质细胞和成釉细胞的分化,尤其在成牙本质细胞和成釉细胞极性的形成与维持中可能具有重要作用。

牙齿发育中细胞周期蛋白D1的表达及其作用的研究

目的： 通过对细胞周期蛋白（ｃｙｃｌｉｎ） Ｄ１ 及其与细胞增殖和细胞凋亡在牙齿发生、发育过程中的关系研究，以探讨牙齿发育的机制。方法：选用纯系 Ｓ Ｄ 大鼠建立牙齿发育模型，采用原位末端标记法（ Ｔ Ｕ Ｎ Ｅ Ｌ 法） 、免疫组织化学染色技术，观察分析纯系 Ｓ Ｄ 大鼠牙胚发育不同阶段ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１ 的表达及其与增殖细胞核抗原（ Ｐ Ｃ Ｎ Ａ） 和细胞凋亡的关系。结果：在牙胚发育的蕾状期、帽状期、钟状早期的细胞增殖中心处三者表达都很明显。钟状晚期及牙体组织形成后，已分化的成釉细胞、成牙本质细胞中ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１ 表达阴性， Ｐ Ｃ Ｎ Ａ及凋亡阳性细胞也减少，但牙乳头及星网层细胞中可见二者少量阳性细胞。结论：ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１ 的表达与 Ｐ Ｃ Ｎ Ａ和细胞凋亡有内在的相互作用关系，三者共同在牙齿发育中发挥重要的调控作用。

胎鼠牙胚细胞体外培养研究

目的 摸索正常胎鼠牙胚细胞离体培养所需条件 ,为进一步将其作为牙组织工程种子细胞奠定基础。方法 体视显微镜下取 17d龄胎鼠下颌第一磨牙牙胚 ,胶原酶 /分离酶消化 ,以含 10 %胎牛血清 (FCS)的DMEM为培养基进行原代培养。倒置显微镜下观察培养细胞的生长特点 ,MTT法测定细胞活性绘制生长曲线 ,取原代培养 4～ 9d的细胞进行组织化学和免疫组织化学染色。结果 倒置显微镜下观察 ,培养细胞在 2 4h内贴壁 ,约 7～ 9d生长连成片状 ,细胞有多角形、大而扁平梭形和长梭形几种形态。生长曲线表明 :培养细胞在前 3天生长缓慢 ,第 4天呈对数生长 ,第 7天达高峰。免疫组化结果表明 :培养细胞来源于两种组织。结论 采用酶消化培养法 ,用胶原做基质饲养层 ,含 10 %FCS的低糖DMEM作为培养基 ,能将胎鼠牙胚细胞培养成活 ,并维持其细胞学特征。

牙胚细胞与骨形态发生蛋白4转染的骨髓间充质干细胞相互诱导的体外实验研究

目的:探讨牙胚细胞和骨形态发生蛋白4(BMP4)转染的骨髓间充质干细胞(BMSCs)相互间的成牙诱导作用。方法:构建骨形态发生蛋白4慢病毒载体,转染SD大鼠骨髓间充质干细胞,并将骨髓间充质干细胞和BMP4转染的骨髓间充质干细胞分别与SD大鼠牙胚细胞按1∶1比例混合培养,同时将细胞分为5组,BMSCs组、BMP4/BMSCs组、牙胚细胞组、BMSCs/牙胚细胞组(混合组1)、BMP4/BMSCs/牙胚细胞组(混合组2),分别采用实时荧光定量PCR和western-blotting检测五组细胞Ⅰ型胶原蛋白、成釉蛋白、牙本质基质蛋白1、同源异型盒基因1成牙相关基因mRNA水平和蛋白水平相对表达量的变化。结果:与混合组1相比,混合组2Ⅰ型胶原蛋白、成釉蛋白、牙本质基质蛋白1、同源异型盒基因1mRNA水平和蛋白水平表达量增多,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:牙胚细胞与BMP4转染的骨髓间充质干细胞共培养,促进了成牙相关基因的表达,可作为组织工程牙的备选种子细胞。

胶质源性神经营养因子在人牙胚和体外培养的人牙乳头间充质细胞中表达的实验研究

目的 :观察胶质源性神经营养因子 (GDNF)在人牙胚和体外培养的人牙乳头间充质细胞中表达部位及其表达变化。方法 :应用免疫组织化学和免疫细胞化学技术。结果 :GDNF在人牙乳头间充质细胞和人牙胚免疫组化染色呈阳性结果 ,表达位于人牙乳头间充质细胞以及牙胚的成牙本质细胞和前期牙本质细胞层 ,为胞浆内着色 ,呈黄褐色。结论 :GDNF可能参与促成牙本质细胞分化 。

基质金属蛋白酶8在小鼠胚胎期牙胚发育中表达的研究

目的:观察基质金属蛋白酶-8(MMP-8)在小鼠胚胎不同时期,牙胚发育中的表达及分布,探讨其在小鼠牙胚发育过程中可能的作用。方法:制备小鼠胚胎期E13.5,E14.5,E16.5,E18.5天的下颌第一磨牙牙胚的石蜡切片,通过免疫组织化学染色技术检测MMP-8在这4个发育时期牙胚组织中的表达分布情况。结果:MMP-8在蕾状期(E13.5天)表达于成釉器表层的上皮细胞及周围的间充质细胞,在帽状期(E14.5天)表达于釉结,在钟状早期(E16.5天)表达于外釉上皮层、内釉上皮层、星网状层、中间层及牙囊,在钟状中期(E18.5天)表达于分化中成釉细胞和成牙本质细胞、中间层及外釉上皮层。结论:MMP-8在牙胚发育中可能调控成釉细胞和成牙本质细胞分化及前期硬组织的分泌、改建和成熟过程。

牙胚微环境对皮肤真皮多能干细胞特性的影响

目的:研究皮肤真皮多能干细胞诱导后成牙分化的可行性,以期为组织工程再生牙齿探寻一种可靠的成体干细胞。方法:使用大鼠胚胎期发育牙胚制备条件培养基,诱导皮肤真皮多能干细胞分化,检测诱导后细胞增殖变化、矿化能力以及体外检测基因表达和细胞表型。结果:大鼠胚胎期发育牙胚细胞条件培养基诱导皮肤真皮多能干细胞后,皮肤真皮多能干细胞增殖加快、矿化能力增强,同时,诱导组细胞中可检测到ALP、OCN、BSP mRNA以及DSP和DMP-1 mRNA的表达,进一步细胞表型分析显示,诱导组皮肤真皮多能干细胞表达DSP、DMP-1以及ALP阳性。结论:利用发育早期牙胚细胞分泌的信号分子在体外模拟牙胚发育的微环境,使得皮肤真皮多能干细胞实现了向牙源性间充质细胞方向的表型转化。

Dlx_1基因在大鼠外胚间充质细胞中表达的研究

目的 探讨Dlx1基因在牙胚发育过程中的调控作用。方法 采用外胚间充质细胞组织块培养法 ;地高辛标记cDNA原位杂交检测方法和斑点杂交方法 ,观察Dlx1基因在大鼠外胚间充质细胞 ,人牙乳头细胞 ,人牙髓细胞中的表达情况。结果 Dlx1基因在外胚间充质细胞和人牙乳头细胞中mRNA呈强阳性表达 ,而在牙髓细胞中弱表达。结论 Dlx1基因是牙胚发育过程中重要的调节因子 ,这种调控作用具有一定的时间性与空间性 ,它可能主要参与调控早期未分化细胞 。

体外器官培养人牙胚的实验观察

目的 建立人牙胚发育的体外器官培养模型。方法 将3.5个月胎龄人胚胎的乳牙牙胚置于微孔滤膜上利用BGJb培养基培养,常规组织学观察。结果 人乳牙牙胚在体外培养期间继续发育,牙齿形成细胞(成釉细胞和成牙本质细胞)分化程度进—步提高。结论 这种培养条件可以保持人牙胚的体外发育。

骨髓间充质干细胞向成牙本质样细胞分化的体外实验研究

目的:观察骨髓间充质干细胞向成牙本质样细胞分化的能力。方法:分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞、胎鼠牙胚细胞,制备牙胚细胞条件培养液;用牙胚细胞条件培养液诱导SD大鼠骨髓间充质干细胞7d,通过免疫荧光染色和RT-PCR方法,观测其表达成牙本质细胞特异性标志物—牙本质涎蛋白(DSP)、牙本质基质蛋白1(DMP-1)的情况,明确骨髓间充质干细胞能否向成牙本质样细胞分化。结果:大鼠骨髓间充质干细胞在诱导体系中生长状态良好。培养7d后,部分细胞抗牙本质涎蛋白(DSP)、抗牙本质基质蛋白1(DMP-1)免疫荧光染色呈阳性;RT-PCR显示mRNA水平表达牙本质涎磷蛋白(DSPP)和牙本质基质蛋白(DMP-1)。结论:大鼠骨髓间充质干细胞在牙胚细胞条件培养液的诱导下可以分化为成牙本质样细胞。

2种不同成牙本质诱导液对大鼠脂肪干细胞增殖凋亡的影响

目的探索2种不同的成牙本质诱导液——牙胚条件培养液(TGC-CM)和牙本质非胶原蛋白(DNCPM)对大鼠脂肪干细胞增殖和凋亡的影响。方法 (1)取出生4d的SD乳鼠4只,分别取腹股沟脂肪组织,用酶消化法进行脂肪干细胞分离和培养,免疫细胞化学法对细胞进行鉴定。(2)2种诱导液作用细胞后,倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,MTT法检测细胞增殖情况,Annexin/PI双染后流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。结果 (1)细胞培养至第2代时表型分子CD44和CD105表达呈阳性。(2)经TGC-CM及DNCPM培养3d后形态上发生极性改变。培养6d后,TGC-CM培养的细胞数量未见明显改变,而DNCPM培养的细胞密度明显降低。(3)MTT结果显示DNCPM组OD值低于对照组及TGC-CM组(P<0.05),流式细胞凋亡检测仪检测DNCPM组细胞凋亡率高于TGC-CM组和对照组(P<0.05)。结论作为大鼠脂肪干细胞向成牙本质样细胞方向分化的诱导液,TGC-CM可能更具优势。