岩黄连总生物碱抑制M2型巨噬细胞抗小鼠肝癌实验研究

目的:探讨岩黄连总生物碱能否通过负调控PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制M2型巨噬细胞发挥抗小鼠H_(22)肝癌细胞实体瘤生长的作用。方法:建立小鼠H_(22)肝癌细胞实体瘤模型,岩黄连总生物碱高、中、低剂量(100、50、25 mg/kg)给药10 d后,称量瘤体及脾脏、胸腺质量,计算脏器系数,HE染色观察肿瘤组织病理学改变,RT-qPCR检测瘤组织M2型巨噬细胞标志物CD206 mRNA表达。体外培养RAW264.7细胞,用IL-4、IL-13(20 ng/mL)诱导细胞M2极化,岩黄连总生物碱高、中、低浓度(25、12.5、6.25μg/mL)干预24 h,流式细胞仪检测CD206阳性表达;RT-qPCR检测CD206、ARG-1、IL-10 mRNA表达;Western Blot检测RAW264.7细胞内PI3Kp110、p-AKT、p-mTOR蛋白表达。结果:动物实验结果显示,岩黄连总生物碱高、中剂量H_(22)肝癌细胞实体瘤的生长受到抑制,脾脏系数与胸腺系数显著升高(P<0.05),HE染色切片中肿瘤细胞浸润数减少,区域坏死肿瘤组织中CD206 mRNA表达显著降低(P<0.05或P<0.01)。细胞实验结果显示,岩黄连总生物碱高、中浓度组M2型巨噬细胞标志物CD206阳性表达及CD206、ARG-1、IL-10 mRNA和通路PI3Kp110、p-AKT、p-mTOR蛋白表达显著降低(P<0.05或P<0.01)。结论:岩黄连总生物碱可通过负调控PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制巨噬细胞M2型极化发挥抗小鼠H_(22)肝癌细胞实体瘤生长作用。

岩黄连总生物碱对四氯化碳诱导肝纤维化大鼠的改善作用研究

目的研究岩黄连总生物碱对四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)诱导的肝纤维化大鼠的保护作用及机制。方法通过向SD大鼠腹腔给予30%CCl4橄榄油溶液(0.1 mL/100 g)诱导复制肝纤维化模型,2次/周,连续12周。将肝纤维化大鼠随机分为模型组,岩黄连总生物碱低、中、高剂量(25、50、100 mg/kg)组及联苯双酯(30 mg/kg)组,另设正常组大鼠,各组均为8只。各给药组于造模第11周按设定剂量灌胃相应药物(1.0 mL/100 g)干预,1次/d,连续2周。正常组与模型组大鼠每天灌胃等体积的生理盐水。末次给药24 h后,收集大鼠血清、肝脏及脾脏组织,测定大鼠肝脾指数;采用HE染色和Masson染色观察肝组织病理学变化。比色法检测各组血清丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、总蛋白(total protein,TP)、白蛋白(albumin,ALB)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)与谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)的含量;通过ELISA检测血清透明质酸(hyaluronic acid,HA)、层粘连蛋白(laminin,LN)、Ⅲ型前胶原(typeⅢprocollagen,PCⅢ)及Ⅳ型胶原(collagenⅣ,Ⅳ-C)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)及白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)表达水平。结果与正常组相比,模型组大鼠反应迟钝,肝脾指数增大(P<0.01),肝组织呈现明显纤维化,血清ALT、AST、MDA、LN、HA、PCⅢ和Ⅳ-C水平显著升高(P<0.01),血清TP、ALB、SOD及GSH-Px水平显著下降(P<0.01);血清中TGF-β1、IL-1β、IL-8及IL-6蛋白表达水平显著上调(P<0.01)。与模型组比较,岩黄连总生物碱中、高剂量组均能明显改善大鼠状态和肝脾指数(P<0.05,P<0.01),有效调节大鼠肝组织病理学损伤和纤维增生;显著降低大鼠血清ALT、AST、MDA含量(P<0.01),明显提高血清TP、ALB、SOD及GSH-Px的表达水平(P<0.05,P<0.01);并能明显下调LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C、TGF-β1、IL-1β、IL-8及IL-6蛋白的表达水平(P<0.05,P<0.01)。结论岩黄连总生物碱具有明显的抗肝纤维化作用,其作用机制可能与抗氧化、抑制炎症因子表达相关。

岩黄连总碱下调miR-223表达调控人牙龈成纤维细胞增殖与凋亡的分子机制研究

目的:探讨岩黄连总碱对牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Pg-LPS)诱导的人牙龈成纤维细胞增殖与凋亡的影响及其可能作用机制。方法:体外培养人牙龈成纤维细胞,分为对照组(NC组)、Pg-LPS组、5μg/ml岩黄连总碱+Pg-LPS组、10μg/ml岩黄连总碱+Pg-LPS组、20μg/ml岩黄连总碱+Pg-LPS组、miR-NC+Pg-LPS组、miR-223+Pg-LPS组、anti-miR-NC+Pg-LPS组、anti-miR-223+Pg-LPS组、20μg/ml岩黄连总碱+Pg-LPS+miR-NC组、20μg/ml岩黄连总碱+Pg-LPS+miR-223组。采用EDU、流式细胞术分别检测细胞增殖与凋亡;RT-qPCR法检测miR-223的表达量;ELISA法检测白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;Western blot检测剪切的半胱天冬氨酸蛋白酶3(Cleaved-caspase-3)、pro-caspase-3、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)蛋白表达。结果:岩黄连总碱(5、10、20μg/ml)和下调miR-223表达可显著升高Pg-LPS诱导的人牙龈成纤维细胞增殖活力和pro-caspase-3蛋白表达水平,降低细胞凋亡率、IL-1β和TNF-α水平以及Cleaved-caspase-3、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表达水平(均P<0.05)。过表达miR-223可逆转岩黄连总碱对Pg-LPS诱导的人牙龈成纤维细胞增殖、凋亡及PI3K/AKT通路的作用。结论:岩黄连总碱可通过下调miR-223表达而抑制PI3K/AKT信号通路从而促进Pg-LPS诱导的人牙龈成纤维细胞增殖,并抑制细胞凋亡和炎性反应。

分光光度法测定岩黄连不同部位总生物碱的含量

目的建立一种简单快速的方法来测定岩黄连总生物碱含量,为岩黄连质量控制提供依据。方法采用氯仿超声提取岩黄连不同部位样品,依据酸性染料比色法的原理,以盐酸小檗碱为对照,溴甲酚绿为指示剂,在416 nm波长下比色测定样品中总生物碱含量。结果吸光度值与生物碱含量线性关系良好(r=0.999 1);回收率为101.91%,RSD为1.75%;测定结果在3 h内稳定,RSD为1.09%;岩黄连根部生物碱含量最高,达到48.77 mg/g,叶和夹果其次,花和茎中最低。结论该测定方法简便可靠,可用于岩黄连质量控制;部位不同总生物碱含量也不同。

不同干燥方法对岩黄连中脱氢卡维汀及总生物碱含量的影响

目的:研究探讨不同干燥方法对岩黄连药材不同部位(根、茎、叶、花序)中主要有效成分脱氢卡维汀及其总生物碱含量的影响。方法:对不同干燥方法所得岩黄连药材不同部位中脱氢卡维汀(HPLC法)和总生物碱(紫外分光光度法)的含量进行测定和统计分析。结果:与传统干燥方法(阴干、晒干、60℃烘干)相比,常温真空干燥法和真空冷冻干燥法所得岩黄连药材中脱氢卡维汀含量相对较低,而阴干法所得药材中脱氢卡维汀的含量较高,其中根和花序中脱氢卡维汀含量最高,分别为冻干法所得药材的相应部位中含量的3.4倍和2.2倍。不同干燥方法对药材各部位中总生物碱含量的影响与对脱氢卡维汀含量的影响基本一致。结论:岩黄连采收后,干燥方法对所得干燥药材中脱氢卡维汀及总生物碱的含量有较大影响,以阴干法所得药材中二者的含量最高。

大孔吸附树脂分离岩黄连总生物碱的研究

利用大孔吸附树脂分离岩黄连中的总生物碱,采用静态和动态吸附-解吸附方法,以总生物碱和脱氢卡维丁含量为指标,考察了6种大孔吸附树脂对岩黄连总生物碱的吸附能力,其中D101型大孔吸附树脂的比吸附量和比洗脱量均较高。优化后的提取工艺为:上样药液原药材浓度0.2g/ml,吸附流速为2BV/h,解吸附溶剂为60%乙醇(3BV),所得岩黄连提取物中总生物碱含量大于60%。

不同产地岩黄连中总生物碱和脱氢卡维丁的比较研究

目的建立岩黄连中总生物碱和脱氢卡维丁的含量测定方法,并探讨不同产地岩黄连二者含量。方法以脱氢卡维丁为对照,分光光度法测定总生物碱含量;RP-HPLC法测定脱氢卡维丁含量,以Lichrosopher-C18柱为分析柱,0.01mo1/LKH2PO4水溶液(用磷酸调pH=3)-乙腈(75∶25)为流动相,检测波长347 nm,柱温30℃,流速1.0 ml/min。结果广西和贵州产的岩黄连药材总生物碱和脱氢卡维丁含量较高,且广西产的药材两者含量较稳定。结论所建立的方法操作简便快速,结果准确可靠。测定的不同产地样品中,以广西产的药材质量较好且稳定。

岩黄连药材的提取工艺研究

目的正交实验优选岩黄连药材的最佳提取工艺。方法以岩黄连中总生物碱、脱氢卡维丁的含量为指标,比较乙醇和酸水两种不同提取溶媒以及回流、渗漉两种不同提取方法,采用L9(34)正交设计,对影响岩黄连提取工艺中的溶剂浓度、溶剂用量、提取时间、提取次数等4个因素进行优化筛选。结果乙醇提取优于酸水提取,回流法提取效果优于渗漉法。醇提最佳工艺条件为:用75%乙醇提取,每次加醇量10倍,提取3次,每次提取时间2h。结论优选得到的工艺简便、稳定、可行。

高速逆流色谱法分离岩黄连中的生物碱类成分

目的:从岩黄连的粗提物中快速分离生物碱类成分。方法:采用高速逆流色谱技术,以正丁醇-乙酸乙酯-水-甲酸(5∶1∶5∶0.01)和正丁醇-乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸(5∶5∶1∶9∶0.05)作为两相溶剂系统分离岩黄连中的主要生物碱。结果:经过连续三次色谱分离,从岩黄连的正丁醇粗提物(300 mg)中得到6个纯度较高的生物碱,分别为:scoulerine(3.6 mg,质量分数:71%)、isocorydine(9.2 mg,质量分数:92%)、dehydrocheilanthifoline(5.5 mg,质量分数:85%)、dehydrocavidine(7.5 mg,质量分数:76%)、palmatine(20.4 mg,质量分数:90%)、berberine(20.9 mg,质量分数:97%)。结论:采用高速逆流色谱法制备分离岩黄连中的生物碱,省时、方便、产物得率和纯度较高。

酶法提取岩黄连总生物碱的研究

目的研究植物提取酶在提取岩黄连总生物碱中的应用。方法岩黄连药材经酶处理后用乙醇回流提取总生物碱,通过正交实验优化酶处理工艺参数。结果酶解反应的最佳工艺条件为:温度45℃、酶反应时间16h、pH5.0、酶用量0.9%。结论药材经酶处理后再用乙醇回流提取,对总生物碱的提取率比传统的直接乙醇回流提取法的提取率提高约24%,适用于岩黄连总生物碱的辅助提取。

岩黄连总生物碱对小鼠免疫功能的影响

本文研究了岩黄连总生物碱（ＣＳＢＴＡ）对小鼠免疫功能的调节作用，发现ＣＳＢＴＡ在体内增强溶血空斑值和增强小鼠的迟发型超敏反应。在体外增强同种异型小鼠脾细胞的混合培养反应和增强有丝分裂原刺激脾细胞的增殖反应，另外ＣＳＢＴＡ增强Ｔ细胞产生ＩＬ－２和ＩＦＮ－γ的水平，提示ＣＳＢＴＡ在免疫调节中是一种增强剂。

岩黄连总碱对小鼠急性化学性肝损伤的保护作用研究

目的:研究岩黄连总碱对CCl4所致小鼠急性肝损伤的保护作用。方法:腹腔注射给予CCl4致小鼠急性肝损伤,通过灌胃给药观察岩黄连总碱对其保护作用。结果:岩黄连总碱可明显降低CCl4因素所致急性肝损伤小鼠血清AST、ALT的含量。结论:岩黄连总碱对CCl4所致小鼠急性肝损伤具有保护作用。

UPLC-Q-TOF-MS/MS法定性与HPLC法定量分析岩黄连总碱成分

目的:定性分析岩黄连总碱化学成分,并对其中8个含量较高的生物碱类成分进行定量分析。为研究岩黄连总碱的药效物质基础提供依据,也为岩黄连总碱质量控制提供参考。方法:采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱联用技术(UPLC-Q-TOF-MS/MS)定性分析岩黄连总碱化学成分,并用高效液相色谱法(HPLC)同时测定岩黄连总碱中原阿片碱、非洲防己碱、延胡索乙素、黄连碱、脱氢卡维丁、巴马汀、小檗碱和白屈菜红碱的含量。结果:岩黄连总碱提取物中共鉴定出38个生物碱类成分,其中原小檗碱类13个,小檗碱类9个。此外,定量分析的8个成分在各自范围内线性良好(r>0.999 2),加样回收率96.70%~103.8%,RSD 0.68%~1.97%。结论:该方法专属性好,准确性高,可用于岩黄连总碱提取物的定性、定量分析。

脱氢卡维丁的肠道转运特性研究

目的研究岩黄连生物碱中主要活性成分脱氢卡维丁的肠道转运特性。方法采用外翻肠囊模型,以单位面积渗透量及表观渗透系数为指标,研究不同质量浓度岩黄连生物碱中脱氢卡维丁在大鼠不同肠段的转运特性;采用Ca-co-2细胞单层模型研究脱氢卡维丁的双向跨膜转运行为及盐酸维拉帕米对其转运的影响。结果脱氢卡维丁在大鼠不同肠段部位的离体肠囊上均有转运,试验质量浓度下同一部位肠段的表观渗透系数无显著性差异;脱氢卡维丁在Ca-co-2细胞单层的双向转运存在显著性差异,加入盐酸维拉帕米后,吸收渗透系数显著增大。结论脱氢卡维丁的肠黏膜转运存在转运蛋白的外排机制,但在较高浓度范围内呈现被动转运特征。

岩黄连总碱对Tca8113细胞增殖和凋亡作用的影响

目的:观察岩黄连总碱对体外培养人舌鳞癌Tca8113细胞增殖抑制及诱导凋亡作用。方法:MTT法检测不同浓度的岩黄连总碱分别处理体外培养的Tca8113细胞24、48和72 h后的细胞增殖抑制情况,Hochest33258染色及DNA ladder检测细胞凋亡,并用脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL法)原位检测细胞凋亡及细胞凋亡率。结果:岩黄连总碱对Tca8113细胞增殖具有明显抑制作用(P<0.01),且呈现出一定的时间和浓度依赖性;Hochest33258检测发现岩黄连总碱作用48 h后可见凋亡细胞;DNA ladder检测可见凋亡特有的180～200 bp整数倍DNA条带;TUNEL结果显示岩黄连总碱处理组细胞凋亡率呈时间和浓度依赖性。结论:岩黄连总碱能抑制Tca8113细胞增殖,呈时间和浓度依赖性;同时能诱导Tca8113细胞凋亡,且诱导凋亡的作用也呈时间和浓度依赖性。

岩黄连总生物碱提取工艺及抗氧化活性研究

以脱氢卡维丁得率为评价指标,采用单因素实验及正交试验确定岩黄连中总生物碱的最佳提取工艺,并采用自由基清除法评价其抗氧化活性。实验结果表明,岩黄连总生物碱的最优提取工艺为:提取温度80℃,提取时间2.5 h,乙醇体积分数60%,料液比1∶14,提取3次,在此条件下得率为7.34%;抗氧化活性实验表明,岩黄连生物碱粗提物对DPPH自由基、超氧阴离子自由基有较好的清除作用,对ABTS自由基和羟基自由基有一定程度的清除作用,呈现浓度依赖性,表明岩黄连生物碱粗提物是潜在的天然抗氧化剂。

岩黄连总碱对巨噬细胞M1型分化的抑制作用

目的:研究岩黄连总碱(CSBTA)对巨噬细胞M1型分化的影响。方法:THP-1细胞经佛波脂(PMA)刺激48 h诱导分化为巨噬细胞(Mφ)。倒置显微镜观察细胞形态变化,流式细胞术检测巨噬细胞表面分子CD11b、CD14;加入脂多糖(LPS,1μg/mL)、γ干扰素(IFN-γ,20 ng/mL)刺激48 h诱导Mφ巨噬细胞分化为M1型巨噬细胞。不同浓度(0.0025 g/L-0.02 g/L)CSBTA干预M1型巨噬细胞24 h。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-6 mRNA相对表达量,Western blotting法检测M1型巨噬细胞CD86蛋白表达量,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测细胞培养上清液中IL-1β的含量。结果:0.02 g/L的CSBTA对M1型巨噬细胞活力产生明显的毒性作用(P<0.05)。在0.0025 g/L、0.005 g/L CSBTA的干预下,M1型巨噬细胞IL-6和TNF-αmRNA相对表达量、CD86蛋白表达量及IL-1β含量均显著降低(均P<0.05)。结论:CSBTA可以有效抑制THP-1源性巨噬细胞M1型的分化,并改善炎症环境。

SiO_(2)@松香基高分子(Ru131)色谱柱分离测定岩黄连中脱氢卡维丁、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱

建立测定岩黄连中脱氢卡维丁、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱含量的液相色谱分析方法。确定了脱氢卡维丁、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱的色谱分离条件为:SiO_(2)@松香基高分子(Ru131)色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以乙腈-0.0050 mol·L^(-1)磷酸盐缓冲溶液(pH=3.0)=20∶80(V/V)为流动相,紫外检测波长347 nm。脱氢卡维丁、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱分别在9.040~69.76μg·mL^(-1)、4.950~38.16μg·mL^(-1)、2.140~16.47μg·mL^(-1)范围内与色谱峰面积呈良好线性关系(R^(2)≥0.9992),3种生物碱的平均加入回收率分别为97.95%(RSD=2.30%)、102.5%(RSD=2.06%)和96.10%(RSD=2.47%)。该方法准确、可靠,结果重现性好,可应用于草药岩黄连中生物碱含量测定和药材质量的评价。

岩黄连总碱药效物质基础及药理作用机制研究进展

岩黄连作为一种传统的民间中药,具有清热、解毒、止痛、止血之功效。目前针对岩黄连药理作用及其作用机制的研究主要涉及保肝、镇痛、抗肿瘤、抗菌等方面。岩黄连发挥药理作用的化学成分主要是生物碱类成分,统称为岩黄连总碱(Corydalis saxicola Bunting total alkaloids,CSBTA),而关于岩黄连总碱中发挥药理作用的物质基础的研究较少。本文就岩黄连总碱的药效物质基础、药理作用及其机制的研究进展进行综述,为该药物的临床合理应用与基于新剂型以及新适应证等的进一步开发提供参考。

岩黄连总生物碱对中枢抑制作用的初步研究

目的以岩黄连总生物碱(Total alkaloids of Corydalis saxicola Bunting,TACS)为研究对象,考察其对中枢的抑制作用。方法灌胃给药后,观察TACS对小鼠自发活动的影响和对戊巴比妥钠诱导对睡眠时相的影响以及对抗尼可刹米导致小鼠惊厥实验。结果TACS可以减少小鼠自主活动次数,延长小鼠睡眠时间,对抗尼可刹米所致的惊厥。结论TACS对中枢有一定的抑制作用。