toxR基因作为荧光定量PCR靶基因设计TaqMan探针快速检测副溶血弧菌

以toxR基因为靶基因,通过优化反应条件建立了快速检测副溶血弧菌的TaqMan实时荧光PCR方法。特异性试验表明,该方法能选择性检测副溶血弧菌,而与金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特杆菌等多种常见的食源性病原菌没有交叉反应;灵敏度试验表明,该方法最少可检测到25个拷贝的toxR基因重组质粒,对纯培养物和模拟食品样品直接检测的灵敏度分别为21 cfu/mL和210 cfu/g;重复性试验表明,同一样品于试验内及试验间的变异系数分别为0.9%和1.3%;所制作的标准曲线在2.5×101～2.5×106拷贝数之间有较好的线性关系,能对副溶血弧菌进行准确的定量分析。结果表明,本研究所建立的副溶血弧菌实时荧光PCR检测方法具有特异性好、灵敏度高、重复性好的特点,能进行定量检测,而且检测时间从核酸抽提到出实验结果仅需要3 h,是快速检测副溶血弧菌的有效手段。

基于toxR基因病原哈氏弧菌PCR检测方法的建立

基于toxR基因序列设计检测哈氏弧菌的1对特异性引物,通过PCR反应条件优化、PCR反应特异性及敏感性检测,建立一种哈氏弧菌的特异性分子检测方法。试验结果表明,该引物可使哈氏弧菌扩增出大小为390 bp的toxR基因片段,3种水产动物病原弧菌未扩增出任何条带,敏感性检测结果为该PCR反应最低能检测出0.375 ng/μl的哈氏弧菌基因组DNA。该试验建立的基于toxR基因的哈氏弧菌的PCR检测方法可用于哈氏弧菌引起的水产动物疾病的快速诊断及海产品安全检测。

基于lolB和toxR基因的水产品中霍乱弧菌双重PCR检测方法

选择lolB和toxR两种基因序列设计2对特异性引物,建立一种针对霍乱弧菌所有生物型菌株的双重PCR检测方法,扩增目的片段大小分别为519bp和779bp。结果表明:在同步扩增中,仅霍乱弧菌模板可同时扩增出2种基因片段,4株对照菌模板无任何扩增条带;敏感性检测结果显示,该双重PCR最低能检测3.42×103CFU/mL菌落数的霍乱弧菌。所建立的基于lolB和toxR两种基因的双重PCR检测方法特异性强、敏感性高、方法简单、用时短,可用于霍乱弧菌检测。

食品中副溶血性弧菌toxR和tdh基因双色荧光PCR检测方法的建立

目的建立对副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)特异性检测toxR(跨膜转录激活蛋白)基因和tdh(热稳定性直接溶血素)毒力基因的Taqman探针双色荧光PCR检测方法。方法根据副溶血性弧菌toxR基因和tdh基因,分别设计引物和探针,建立Taqman探针双色荧光PCR扩增体系,进行特异性、灵敏度试验;对副溶血性弧菌分离菌株实施检测,了解其tdh基因和tdh基因分布情况。结果结果表明,副溶血性弧菌标准菌株和3株从食物中毒患者中分离获得的分离株均出现toxR基因和tdh扩增曲线,而溶藻弧菌、单增李斯特菌等31株弧菌属其他菌株和肠杆菌科的菌株未见扩增曲线。从食品中分离的37株副溶血性弧菌分离株均未携带tdh毒力基因。副溶血性弧菌检测灵敏度可达到3.6×102cfu/mL。结论该方法可用于同时检测食品中副溶血性弧菌的特异性和毒力基因。

拟态弧菌全长toxR基因的克隆和序列分析

对克隆的拟态弧菌Vibrio mi micus的全长toxR基因及进行相关的序列分析。根据已发表的其他几种弧菌toxR基因两翼核苷酸序列,设计和合成上下游简并引物,以拟态弧菌1.1969标准株的基因组DNA为模板进行PCR扩增,将获得的1.3kb扩增片断进行克隆、鉴定和测序,并将该序列提交至GenBank(登录号为EF693743)。首次获得拟态弧菌840bptoxR基因全长核苷酸序列。与其它弧菌的相应序列分析比对显示,该序列与霍乱弧菌Vibrio cholerae的toxR基因有87%—88%的相似性,与鳗弧菌Vibrio anguillarum的toxR基因有75%的相似性,与副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus的toxR基因有45%的相似性。该基因编码1个含有279个氨基酸残基的蛋白质,其分子量为31.13kDa,等电点为5.35,并含有一个典型的转录激活区和一个跨膜区。系统发育树分析表明,几种常见致病性弧菌的toxR基因序列存在较大分歧,拟态弧菌能较容易与进化相近的霍乱弧菌鉴别区分开来。toxR基因全长核苷酸序列的获得将为拟态弧菌的菌种鉴定增添新的分子靶标,有助于其结构和功能的研究及通过突变分析鉴定出新的受toxR基因调控的致病基因。

霍乱弧菌毒力表达调控基因toxR的PCR扩增及克隆

为了构建霍乱弧菌和杜氏利什曼原虫双价口服活疫苗候选株 ,作者采用 PCR对霍乱弧菌毒力表达调控基因 tox R进行扩增及克隆 ,并对霍乱弧菌 tox R基因进行限制性酶切分析。结果显示 :7株霍乱弧菌均扩增出 1 .3kb的 tox R基因片段 ,tox R基因中部含有 Eco R 酶切位点 ,再将 tox R基因克隆在质粒 p AT1 5 3上 ,对所获的重组质粒 pt R4进行限制性酶切分析 ,证实质粒 pt R4插入的 1 .3kb的 DNA片段为 tox

基于blaCARB-17和toxR基因的副溶血弧菌双重PCR检测方法的建立

建立一种针对副溶血弧菌bla_(CARB-17)和toxR基因的双重PCR检测方法。按照副溶血弧菌的bla_(CARB-17)和toxR基因序列设计并合成引物,于同一反应体系中进行PCR扩增,优化退火温度、退火时间和引物比例,确定双重PCR的特异性和灵敏性,最后用实验室分离鉴定的副溶血弧菌分离株验证。结果表明:建立的双重PCR最佳退火条件是52℃30 s,引物比例1∶1,在同一体系中特异地扩增出副溶血弧菌的bla_(CARB-17)和toxR基因的303、350 bp片段,其它对照菌株均无扩增,表明该方法特异性良好。双重PCR的最低检测限达1×10~2 CFU/mL,对实验室鉴定的56个副溶血弧菌分离株验证均为阳性。建立的双重PCR方法操作简单、高效快速、特异性强,适用于副溶血弧菌的检测。

牡蛎中副溶血弧菌荧光定量PCR检测方法的建立及其应用

以副溶血弧菌毒素调控基因(toxin regulations,toxR)作为靶标基因,设计特异性引物及TaqMan探针,以含toxR基因的质粒为模板,建立质粒拷贝数与CT值的标准曲线,分别采用含toxR基因质粒、纯培养的副溶血弧菌和添加副溶血弧菌的牡蛎(Ostrea)模拟样品进行灵敏度试验,结果表明,其灵敏度分别为15拷贝、18 CFU/mL和180 CFU/mL。同一个样品的30次重复性试验表明,试验内及试验间的变异系数分别为0.95%和1.5%。结果显示,本研究建立的副溶血弧菌荧光定量PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于牡蛎等水产品中副溶血弧菌的定量检测。

水产动物致病性副溶血弧菌双重PCR检测方法的研究

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是多种水产养殖动物的主要病原菌,尤其是可引起凡纳滨对虾幼虾呈毁灭性死亡。本研究基于gyrB和toxR两种基因序列设计2对特异性引物,建立一种副溶血弧菌快速、准确的双重PCR检测方法,扩增目的片段大小分别为285 bp和368 bp。结果表明在同一PCR反应体系中副溶血弧菌可同时扩增大小分别为285 bp和368 bp的2种基因片段,两种引物对4种其他水产动物病原菌无交叉反应;敏感性检测结果显示,该双重PCR最低能检测8.867 2×103 CFU/mL菌体浓度的副溶血弧菌,对副溶血弧菌模板DNA的检出极限为0.029 3 mg/L;对发病中国对虾糠虾幼体、水产品及虾池养殖用水进行双重PCR检测,呈阳性反应的样品可分离出优势生长的副溶血弧菌。该实验所建立的基于gyrB和toxR两种基因的双重PCR检测方法可用于副溶血弧菌引起的水产动物疾病的快速诊断及分子流行病学的调查研究。

TaqMan探针双重荧光PCR法检测副溶血性弧菌

目的:建立同时检测副溶血性弧菌(VP)和其毒力基因的方法。方法:根据VP的toxR基因和tdh基因,分别设计引物和探针,建立基于TaqMan探针双重荧光聚合酶链式反应扩增体系,进行特异性、敏感性实验,并用建立的方法检测从广东地区和辽宁地区进出口食品中分离的VP菌株的毒力基因分布情况。结果:VP标准菌株和3株从食物中毒病人中分离株均出现toxR基因和tdh基因扩增曲线,而31株包括溶藻弧菌、单增李斯特菌等弧菌属和肠杆菌科的菌株扩增结果呈阴性;敏感性实验结果表明,VP浓度与Ct值有很好的反向的线性关系,toxR和tdh线性方程的R2分别为0.999、0.997,最低检测浓度达到3.6×102CFU/mL;检测食品中分离的37株VP只出现toxR基因扩增曲线,未见tdh基因扩增曲线,表明37株VP分离株均未带tdh毒力基因。结论:建立的方法特异性好、灵敏度高,可用于食品中VP的特异性及毒力基因检测。

养殖大黄鱼病原弧菌多重PCR检测技术的建立和应用

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是浙江省养殖大黄鱼(Pseudnosciaena crocea)弧菌病的主要致病菌。本研究选择针对溶藻弧菌和副溶血弧菌的胶原酶基因,哈维氏弧菌的部分ToxR基因的特异性,优化设计了3对特异性引物,通过进行多重PCR反应体系优化,多重PCR产物的测序鉴定与特异性和敏感性实验,建立了一种检测致病性弧菌的多重PCR检测方法。经过琼脂糖凝胶电泳后的条带分析判断,可以在一个PCR管中同时成功地检测这3种病原细菌,含溶藻弧菌、哈维氏弧菌和副溶血弧菌3种致病弧菌核酸的阳性对照样品分别扩增出大小为737bp、382bp和271bp的预期产物,其灵敏度是102～103CFU/mL。将该方法应用于检测人工感染后的养殖大黄鱼病鱼肝脏和肾脏,结果在6份组织样本中,5份检出原始感染菌株,与API20E鉴定结果相符;对弧菌病流行季节采集的未发病的16份养殖大黄鱼组织样本和16份水体样本进行抽检,结果在1份大黄鱼组织样本中检出哈维氏弧菌,7份水体样本中检出这3种弧菌中的1种或2种,鉴定结果与API20E鉴定结果符合率为93.75%。说明该方法不仅可以检测发病鱼,还可以检测无病症带菌大黄鱼以及带菌水样,且说明海洋水体中存在着大黄鱼弧菌病的致病菌。结果说明,多重PCR检测方法具有较高的敏感性与特异性,可以缩短检测时间,降低检测成本,该方法的建立对养殖大黄鱼弧菌病的快速诊断和分子流行病学的调查具有重要意义。

副溶血性弧菌快速检测方法研究

目的以检测toxR基因作为副溶血性弧菌种水平上的特异性基因鉴定,建立一种快速、准确、简便的副溶血性弧菌(VP)筛选方法。方法根据toxR基因序列设计合成引物,扩增被检VP所含的相应基因。分别用标准株及地方株做对照,同时与常规鉴定方法比较。结果对浙江省2005年收集的286株来自临床病人和海产品的可疑VP鉴定,用常规方法鉴定出VP占总数的62.24%;用toxR基因检测,鉴定率占所有菌株的61.54%;两者差异无统计学意义(χ2=0.03,P>0.05),对40份海产品增菌液直接检测toxR基因与常规增菌分离鉴定法,均有37份标本检出VP,检出率为92.5%。结论该检测方法快捷、特异性好、敏感性高,可以作为VP快速筛选方法。

水生动物副溶血弧菌、霍乱弧菌的PCR同步检测方法

副溶血弧菌和霍乱弧菌((non-O1/non-O139型),不仅对水产动物具有广泛和强的致病作用,而且危害人类的健康,是人和水产动物共患病的病原菌。以副溶血弧菌的toxR基因及霍乱弧菌的lolB基因设计2对引物,建立了副溶血弧菌和霍乱弧菌的PCR同步检测方法,相应的扩增目的片段分别为368bp和519bp。在PCR反应体系中副溶血弧菌和霍乱弧菌可扩增出目的基因片段,5株对照菌无任何扩增条带,表明所建立的双重PCR检测方法特异性较强,且所设计的2对引物间无交叉干扰现象;灵敏性试验结果表明,副溶血弧菌的检测最低限1.75×102 cfu/mL,霍乱弧菌的检测最低限1.25×102 cfu/mL,具有较好的灵敏性;人工染菌水产品检测结果显示,人工染菌的8种水产品均为阳性检测结果,而未染菌组均为阴性。本试验建立的双重PCR法特异性强、灵敏性高,可用于副溶血弧菌和霍乱弧菌引起的水产动物疾病的诊断及水产品的安全检测。

PCR结合变性高效液相色谱快速检测水产品中河流弧菌

目的:应用PCR结合变性高效液相色谱技术实现水产品中河流弧菌的快速鉴定。方法:利用河流弧菌的toxR基因序列设计引物,并对该方法进行特异性、精密度和实际应用等方面的考察。结果:用该方法未检测到河流弧菌的近源种及其他细菌的阳性吸收峰,表现出了很好的特异性。结论:用PCR结合变性高效液相色谱检测河流弧菌,不仅特异性好、灵敏度高,且方法简便、快速。

副溶血弧菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

为建立检测副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)的快速检测方法,本研究以VPtoxR基因为靶基因设计合成引物及TaqMan探针,建立了实时荧光定量PCR快速检测VP的方法。结果显示,对15株试验菌株进行实时荧光定量PCR检测,只有VP检测为阳性,表明该检测方法特异性强;该方法的灵敏度为4.9CFU/mL,利用该检测方法对采集的150份样品进行检测,共计检出3份VP阳性样品,与国标法(GB 4789.7—2013)检测结果一致,显示了良好的实用性。该检测方法灵敏度高、特异性强,具有良好的实用性。

基于环介导等温扩增技术水产品中副溶血弧菌快速检测方法的建立与应用

本试验基于环介导等温扩增(LAMP)技术,以副溶血弧菌toxR基因为靶基因,设计两对LAMP引物F3/B3和FIP/BIP,建立了副溶血弧菌LAMP检测方法,60min内即可完成检测。该LAMP方法特异性强、灵敏度高,对纯培养副溶血弧菌的检测灵敏度为42CFU/mL,对污染食品中副溶血弧菌的检测灵敏度为67CFU/mL。实践应用证明,本试验建立的副溶血弧菌LAMP检测方法操作简单、检测结果准确,具有良好的实用性。

副溶血弧菌DPO-PCR检测方法的建立

以副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus,VP）toxR基因为靶基因设计了一对双启动寡核苷酸（DPO）引物,建立了DPO-PCR快速检测VP的方法.结果显示,退火温度在49～69℃都能有效地扩增出目的基因,表明该检测方法对退火温度不敏感;该DPO引物仅与VP的扩增反应呈阳性,而与其他菌株无非特异性扩增反应,表明该方法特异性强;该方法的灵敏度为121 CFU/mL.利用该检测方法对采集的550份样品进行检测,共计检出19份VP阳性样品,与行标法（SN/T 1870-2007）检测结果一致,实用性良好.该DPO-PCR方法设计简单、特异性强,具有良好的实用性.

Taqman-探针荧光定量PCR鉴定副溶血弧菌方法的建立

目的建立一种Taqman荧光定量PCR鉴定副溶血弧菌的方法。方法以副溶血弧菌标准株(ATCC-VPJS421)和其它常见致病菌标准株为研究对象,通过Gene Bank获取toxR基因的序列,采用生物信息学软件设计特异性PCR引物及Taqman探针,在SLAN 96P荧光定量PCR仪进行扩增检测,评价该检测方法的特异度和灵敏度。结果 (1)设计的引物能够扩增出特异性条带;(2)扩增体系中0.5μl探针的扩增效果优于1.0μl探针;(3)Taqman-探针荧光定量PCR检测方法对副溶血弧菌toxR基因的检测灵敏度为10-1 mg/L;(4)在检测粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、霍氏肠杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、梅氏弧菌和弗尼斯弧菌等10种常见致病菌时未出现阳性扩增,特异度为100%。结论成功建立Taqman探针荧光定量PCR鉴定副溶血弧菌的方法,该方法特异度、灵敏度均较好,适用于副溶血弧菌的快速检测,具有良好的应用价值。

基于特异性基因的副溶血性弧菌快速分离鉴定

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是海洋环境中常见的食源性致病菌。采用自行设计的改良初筛方案结合tlht、oxR这2种特异性基因的2次筛选开发了一种副溶血性弧菌的快速分离鉴定方法。应用该法从海水、海泥及3种海产品中分离得到了19株副溶血性弧菌,再经16S rDNA测序对分离鉴定结果的特异性进行了验证。实验结果显示基于tlht、oxR这两种特异性基因分离鉴定所得19株菌的准确性为100%,全程检测时间为3 d。上述结果显示本研究开发的基于特异性基因的副溶血性弧菌分离鉴定法是一种高效、快速的检测方法,特异性强且耗时短,在食源性致病菌的风险评估和大规模样本的分析检测领域具有较高的潜在应用价值。

PCR-焦磷酸测序检测副溶血性弧菌研究

目的建立副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus,VP)的PCR-焦磷酸测序方法。方法根据副溶血性弧菌toxR基因设计扩增引物和测序引物,先用PCR特异性地扩增目的片段,再制备单链模版,最后用焦磷酸测序法检测DNA碱基序列,检测的序列为CCAAGGATTCACAGCAGAAGCCACAGGTGCTTTT,则判断为副溶血性弧菌。结果扩增引物和测序引物表现出良好的特异性。PCR扩增结果:20株VP均扩增出大小为137bp的DNA片段,而创伤弧菌等对照菌株未扩增出DNA条带。焦磷酸测序结果:20株副溶血性弧菌均测出与预期相符的DNA碱基序列,而其他对照菌株未测出DNA碱基序列或检测结果与测序引物后的序列不匹配。VP标准菌株ATCC17802发生A-T突变,密码子CCU变成CCA,而两个密码子都是脯氨酸的密码子。结论该方法特异性高,是快速检测VP有效手段。