细胞壁缺陷对白喉棒状杆菌Tox基因影响

目的探讨细胞壁缺陷对白喉棒状杆菌毒力基因及其表达的影响。方法以非高渗分离培养法诱导并获得产毒性白喉棒状杆菌稳定L型纯培养物,提取白喉棒状杆菌稳定L型的染色体DNA,用Tox基因特异性引物进行PCR扩增,并进行序列测定和分析。分别采用对流免疫电泳(CIEP)和十二烷基磺酸钠-不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测白喉棒状杆菌稳定L型可溶性代谢产物中的白喉毒素蛋白质。结果白喉棒状杆菌在氨苄青霉素作用下可发生细胞壁缺陷而成为L型,该稳定L型的传代培养物可仍然保留同其亲代细菌型一致的Tox基因及其核苷酸序列;但在其可溶性代谢产物中并未检测到白喉毒素蛋白质。结论白喉棒状杆菌稳定L型虽然保留了Tox基因但并不能表达白喉毒素蛋白质,提示细胞壁缺陷可影响Tox基因在宿主菌细胞内的表达。

TOX3基因RNAi慢病毒载体的构建及对乳腺癌ZR-75-1细胞增殖的影响

旨在构建TOX3基因RNAi慢病毒载体并观察其对人乳腺癌ZR-75-1细胞增殖能力的影响。针对TOX3基因设计干扰靶序列,构建载体,测序正确后进行慢病毒包装及滴度测定。转染ZR-75-1细胞,荧光显微镜下观察表达GFP的细胞数目,实时荧光定量PCR及Western blot实验验证转染后ZR-75-1细胞中TOX3 mRNA和蛋白的表达。MTT及平板单克隆实验检测TOX3对ZR-75-1细胞增殖能力的影响。结果显示,各组载体序列正确,病毒滴度均>2×10^8 TU/mL,表达GFP细胞数目均可达95%以上。各干扰组TOX3 mRNA及蛋白表达水平均降低,其中TOX3-shRNA-3组干扰效果最佳,转染后ZR-75-1细胞的增殖和单克隆形成能力下降。成功构建TOX3基因的RNAi慢病毒载体,沉默TOX3后ZR-75-1细胞的增殖能力下降。

白喉毒素及其编码基因TOX在分子生物学中的应用

对白喉毒素及其编码基因的结构及其作用原理进行了详细说明 。

促细胞增殖新基因TOX的功能研究

利用GenBank中的数据,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)从人的cDNA文库中克隆得到功能基因TOX(thymocyte selection-associated high mobility group box),运用生物信息学分析其结构特性,并通过逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)分析TOX在细胞系中的表达;利用荧光显微镜观察其亚细胞定位情况;使用细胞生长曲线实验和流式细胞术分析TOX对细胞增殖及细胞周期的影响.结果表明:TOX基因定位于人8号染色体q12.1上,全长4 131bp,编码526个氨基酸,该蛋白质分子质量约为57ku,含有9个外显子和8个内含子,其编码蛋白为高迁移率蛋白家族成员,能参与基因调控等生理过程;TOX基因在白血病细胞系Jurkat和Raji中高表达,并定位于细胞核中;对细胞生长曲线绘制及细胞周期分析表明,TOX能够使细胞生长速度加快,且S期细胞比例明显上升.说明TOX参与了细胞增殖调控,有可能研究开发为药物靶标或疾病标志物.

靶向调控TOX3基因对乳腺癌细胞增殖及周期的影响

目的研究TOX3基因对人乳腺癌细胞增殖能力及细胞周期的影响。方法采用Western blot法检测已构建的稳定沉默TOX3的ZR-75-1细胞和稳定过表达TOX3的MDA-MB-231细胞中TOX3蛋白的表达。MTT法检测过表达和干扰TOX3基因对乳腺癌细胞增殖活性的影响。平板单克隆实验检测过表达TOX3对MDA-MB-231细胞单克隆形成能力的影响,流式细胞术检测沉默或过表达TOX3后ZR-75-1和MDA-MB-231细胞周期的变化。结果与阴性对照组比较,稳定沉默TOX3的乳腺癌ZR-75-1细胞TOX3蛋白表达明显下降,过表达TOX3的MDA-MB-231细胞TOX3蛋白表达明显上调。过表达TOX3后,MDA-MB-231细胞的增殖活性明显增强,单克隆形成能力增强,G 0/G 1期细胞所占比例明显减少,G 2/M期细胞比例增多。干扰TOX3后,ZR-75-1细胞增殖活性下降,G 0/G 1期细胞比例增加,G 2/M期细胞比例减少。结论靶向调控TOX3基因的表达可改变乳腺癌细胞增殖和单克隆形成能力,影响乳腺癌细胞周期。

昆虫特异性神经毒素基因tox34的合成及转基因烟草的获得

对来自虱状蒲螨（Pyemotestritici）的昆虫特异性神经毒素基因tox34编码成熟蛋白部分的762bp片段，依据植物的偏爱密码子进行了序列改造。将改造后的基因插入细菌表达载体pBV221，经热诱导处理后细菌总蛋白在SDS-PAGE上特异条带的表观分子量为32～33kD。将tox34基因插入植物高效表达载体后以根癌土壤杆菌（Agrobacteriumtumefaciens（SmithetTownsend）Conn）介导的方法导入烟草（NicotianatabacumL．cv．SR1），并获得了转基因烟草植株。经PCRSouthem杂交结果证实，完整的毒素基因已整合入烟草基因组。转基因幼苗根部的组织化学检测GUS显示阳性。再生植株叶片的棉铃虫（HeliothisarmigevaHubner）饲喂实验显示对低龄幼虫有很好的毒杀作用。

TOX基因在恶性肿瘤中的研究进展

恶性肿瘤为严重危害人类健康的疾病,研究证明,癌基因的过度表达及抑癌基因的失活与恶性肿瘤的发生密切相关。TOX基因自发现以来,文献报道其与多种恶性肿瘤的发生相关。在乳腺癌、肺癌、急性白血病、淋巴瘤中,TOX基因结构及表达发生多种变化。本文总结TOX基因在恶性肿瘤中的研究进展及其作为肿瘤分子标志物筛查某些肿瘤的可行性。

TOX3基因-基因、基因-环境交互效应与散发性乳腺癌易感性

目的探讨TOX3基因-基因、基因-环境交互效应在散发性乳腺癌发生中的作用。方法 采用TaqMan单核苷酸多态性（SNP）法检测TOX3基因rs3803662和9302556位点SNPs，采用非条件Logistic回归和MDR法评价基因-基因、基因-环境交互效应、交互效应系数和交互效应最佳模型。结果rs3803662与rs9302556位点变异型基因携带在乳腺癌发生中存在强正交互效应；rs3803662和rs9302556变异型基因与乳腺良性疾病史、口服避孕药等因素在乳腺癌发生中存在交互效应。rs3803662和rs9302556位点变异型基因与行经年限、BMI间的交互效应存在显著的剂量-效应关系（P〈0．05）。携带rs9302556变异型基因、携带rs3803662变异型基因、乳腺良性疾病史、口服避孕药≥1年、吸烟、初潮年龄≤13岁、绝经年龄≥55岁、家族乳腺癌史、BMII≥24．00、月经期≥35年和无哺乳史等11个因子是基因一环境交互效应的最佳模型。结论rs3803662和rs9302556位点变异型基因间存在强正交互效应，基因一环境交互效应在乳腺癌发生中起重要作用。

细胞壁缺陷白喉棒状杆菌致病作用的观察及其毒力基因检测

目的比较白喉棒状杆菌亲代细菌型及其稳定L型动物致病性的差异,了解白喉棒状杆菌稳定L型变异的特点,探讨其变异的性质及其与细胞壁缺陷突变的关系。方法用氨苄青霉素在非高渗培养基内人工诱导产毒性白喉棒状杆菌为稳定L型。采用白喉棒状杆菌稳定L型纯培养物及其代谢产物皮内感染家兔,观察局部感染部位皮肤或全身的病理改变。采用微量法提取白喉棒状杆菌稳定L型的染色体DNA,用Tox基因特异性引物进行PCR扩增以检测毒素蛋白结构基因,并进行序列测定和分析。结果白喉棒状杆菌在氨苄青霉素作用下可发生细胞壁缺陷而成为L型,白喉棒状杆菌稳定L型不能引起动物局部或全身发生异常表现,该稳定L型的传代培养物可仍然保留同其亲代细菌型一致的Tox基因及其核苷酸序列。结论提示细胞壁缺失将导致白喉棒状杆菌与产生毒素蛋白有关结构基因在宿主菌细胞内的表达受到抑制,以致使白喉棒状杆菌稳定L型丧失了产生外毒素致病的作用。

弗尼斯弧菌PCR检测方法的建立及应用

弗尼斯弧菌(Vibrio furnissii)是近年来国内外学者公认的新食源性致病菌,对全球公共卫生和食品安全造成潜在威胁。本研究根据弗尼斯弧菌的toxS基因分别设计了普通PCR引物和实时荧光PCR引物、探针,建立了用于弗尼斯弧菌快速检测的普通PCR方法和实时荧光PCR方法,对这2种方法的特异性和灵敏度进行比较分析。研究表明,建立的普通PCR方法和实时荧光PCR方法特异性良好,检测灵敏度分别为2 400和24CFU/mL,2种方法的检测灵敏度分别是传统培养方法的10和1 000倍,同时对384份水产品和食品样品进行检测,共检出6株阳性菌株。本研究建立的基于弗尼斯弧菌toxs基因的2种PCR方法特异性均为100%,灵敏度分别为2 400和24CFU/mL,完全满足了弗尼斯弧菌的检测标准,可应用于食品样品中弗尼斯弧菌的检测。

TOX3基因单核苷酸多态与中国北方汉族绝经前妇女乳腺癌风险关联的研究

目的:探讨TOX3基因单核苷酸多态与中国北方汉族绝经前妇女乳腺癌风险的关系。方法:采用多重单碱基延伸单核苷酸多态性分型技术(Snapshot)分析方法,检测280例绝经前的乳腺癌患者和287例绝经前的正常对照者TOX3基因rs3803662和rs12443621多态性位点基因型,并比较不同基因型与乳腺癌风险的关系。结果:TOX3基因rs3803662和rs12443621多态性位点基因型频率,在乳腺癌病例组和对照组之间差异无统计学意义,P值分别为0.718和0.340。Logistic回归分析结果显示,对于rs3803662位点,与GG基因型相比,GA、AA和GA+AA基因型与乳腺癌的危险性无关(OR=0.846,95%CI:0.489～1.463,P=0.549;OR=0.802,95%CI:0.470～1.368,P=0.418;OR=0.821,95%CI:0.492～1.368,P=0.449);对于rs12443621位点,与GG基因型相比,GA、AA和GA+AA基因型与乳腺癌的危险性无关(OR=0.755,95%CI:0.518～1.099,P=0.755;OR=0.850,95%CI:0.528～1.368,P=0.504;OR=0.781,95%CI:0.548～1.112,P=0.170)。结论:在目前样本条件下,TOX3基因rs3803662和rs12443621位点多态性与中国北方汉族绝经前妇女乳腺癌易感性之间无明显关联。

弗尼斯弧菌PCR检测方法的建立及应用

目的:弗尼斯弧菌(Vibrio fumissii)是引起世界范围内胃肠功能紊乱的致病菌之一,一般通过摄人生的或者未煮熟的水产品进行传播。本研究旨在建立高效、可靠的PCR检测方法应用于食品中弗尼斯弧菌的快速检测。方法和结果:根据弗尼斯弧菌的toxS基因分别设计普通PCR引物及实时PCR引物、探针,建立普通PCR和实时荧光PCR方法,分别对两种方法的特异性和灵敏度进行比较分析,同时应用于384份食品样品检测。结果表明,建立的普通PCR和实时荧光PCR方法特异性良好,检测灵敏度分别为:2.4×10^3 CFU/ml和24 CFU/ml,并于5 h内完成整个检测过程,同时对384份食品进行检测,共检出6株阳性菌株。结论:本研究建立的PCR检测技术灵敏度高、特异性好,可应用于食品中弗尼斯弧菌的快速检测。