肝豆扶木汤通过JAK/STAT信号通路对TX小鼠肾纤维化的干预作用

目的:研究肝豆扶木汤(GDFMT)对Wilson病肾纤维化小鼠的保护作用及其可能作用机制。方法:将60只成年雄性毒乳鼠(TX)随机分成模型组、GDFMT高、中、低剂量组、青霉胺组,另12只作为正常组的野生小鼠共6组。GDFMT高、中、低剂量组分别予以13.92、6.96、3.48 g·kg^(-1),青霉胺组0.1 g·kg^(-1),模型组及正常组使用等量0.9%氯化钠溶液灌胃,每天1次,连续给药4周。酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清中血尿素氮(BUN),肌酐(CRE),Ⅲ型前胶原(PC-Ⅲ),Ⅳ型胶原(C-Ⅳ)的含量。苏木素-伊红(HE)和马松(Masson)染色的小鼠肾的病理形态学改变。免疫荧光法测定肾细胞内瘦素(leptin)、Janus激酶2(JAK2)及信号传导及转录激活蛋白(STAT)蛋白表达情况;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)测定leptin、瘦素受体(OB-R)、JAK2及STAT mRNA的情况。蛋白免疫印迹法(Western blot)检测转化生长因子-β(1 TGF-β_(1))、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达情况。结果:与正常组比较,模型小鼠BUN、CRE、PC-Ⅲ、C-Ⅳ水平显著增加(P<0.01),与模型组比较,GDFMT高、中剂量组和青霉胺组含量明显降低(P<0.05,P<0.01),GDFMT高剂量组显著减少(P<0.01)。肾组织病理形态结果表明,模型组肾纤维组织增生,用药干预后肾组织病理损害不同程度减轻,纤维化改善。免疫荧光结果显示,模型组leptin、JAK2及STAT3蛋白肾纤维化高表达,GDFMT干预后,荧光强度降低,GDFMT高剂量组荧光强度最低。Real-time PCR结果显示,与正常组比较,模型leptin、OB-R、JAK2、STAT3 mRNA表达水平明显升高,与模型组比较,GDFMT中、高剂量组及青霉胺组表达水平明显降低(P<0.05,P<0.01)。Western blot结果显示,与正常组比较,模型组TGF-β_(1)、MCP-1表达量显著上升(P<0.01),与模型组比较,GDFMT中、高剂量组表达水平显著降低(P<0.01)。结论:GDFMT可以减轻TX小鼠肾纤维化损伤,其机制可能是通过调控leptin及JAK/STAT信号通路表达有关。

基于Pink1/Parkin通路探讨肝豆汤对Wilson病TX模型小鼠的线粒体自噬的影响

目的:观察肝豆汤(GDD)对Wilson病毒奶小鼠(TX)模型海马神经元细胞的线粒体自噬影响,并通过研究PTEN诱导激酶1(Pink1)/E3泛素连接酶(Parkin)介导的线粒体自噬通路,探讨肝豆汤对神经元细胞损伤的保护机制。方法:60只小鼠分为空白组、模型组、肝豆汤低、中、高剂量组(5.5、11、22 g·kg^(-1))和青霉胺组(0.09 g·kg^(-1)),予以相应灌胃8周。采用Morris水迷宫、悬挂实验及爬杆实验检测行为学;苏木素-伊红(HE)染色结合透射电镜观测细胞凋亡、超微结构、细胞自噬及线粒体结构。酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测超氧化物歧化酶(SOD)、活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)水平,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测神经元细胞Pink1、Parkin、自噬标记蛋白(Beclin-1)、微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)、p62的mRNA表达水平,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Pink1、Parkin、Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、p62蛋白的表达。结果:与空白组比较,模型组小鼠定位巡航时间延长,穿越平台次数减少,悬挂得分降低,爬杆时间显著延长(P<0.01);与模型组比较,肝豆汤中、高剂量及青霉胺组小鼠定位巡航时间缩短,穿越平台次数增多,悬挂得分上升,爬杆时间缩短(P<0.01)。与空白组比较,模型组神经元细胞损伤显著,自噬体增多;与模型组比较,肝豆汤中、高剂量组及青霉胺组神经元细胞损伤改善显著,自噬体减少。与空白组比较,模型组MDA、ROS水平升高,SOD水平下降(P<0.01);与模型组比较,肝豆汤低、中、高剂量组MDA、ROS下降,SOD水平显著上升(P<0.01)。与空白组比较,模型组Pink1、Parkin、LC3Ⅱ、Beclin-1的蛋白及mRNA表达水平上升,p62表达水平下降(P<0.05);与模型组比较,肝豆汤中、高剂量组Pink1、Parkin、LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白及mRNA表达水平下降,p62明显上升(P<0.05,P<0.01)。结论:肝豆汤显著的抑制TX小鼠海马神经元线粒体过度自噬,保护神经元细胞的损伤,其机制考虑可能为通过调控Pink1/Parkin通路而实现。

肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化的保护作用及机制研究

目的探讨肝豆扶木汤(Gandou Fumu Decoction, GDFMD)对Wilson病肝纤维化模型TX(toxic milk)小鼠TGF-β_1/Smad信号通路表达的影响。方法 60只TX小鼠随机分为模型组、GDFMD高、中、低剂量组和青霉胺组,每组12只,另设正常组12只。GDFMD高、中、低剂量组按31.2、15.6、7.8 g生药/kg进行灌胃,青霉胺组按0.1 g/kg(0.2 mL/10 g)灌胃,模型组和正常组给予等容积生理盐水,每天1次,连续灌胃4周。采用赖氏法检测血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)活力,溴甲酚绿法检测血清白蛋白(albumin,ALB)含量;采用HE染色、Masson染色观察肝组织病理变化;采用RT-PCR和Western blot检测肝组织中TGF-β_1、Smad2、Smad3、Smad7 mRNA和蛋白的表达。结果 (1)与正常组比较,模型组血清ALT、AST活力升高,ALB含量降低(P<0.01),与模型组比较,GDFMD高、中剂量组和青霉胺组ALT、AST活力降低,ALB含量升高(P<0.01),GDFMD低剂量组AST活力降低,ALB含量升高(P<0.05)。(2)模型组可见肝纤维化特征性病理表现,各用药组均有不同程度改善。(3)与正常组比较,模型组TGF-β_1、Smad2、Smad3 mRNA和蛋白表达升高,Smad7 mRNA和蛋白表达降低(P<0.01),与模型组比较,GDFMD高、中剂量组和青霉胺组TGF-β_1、Smad2、Smad3 mRNA和蛋白表达降低,Smad7 mRNA和蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01),GDFMD低剂量组TGF-β_1 mRNA和蛋白、Smad2蛋白表达降低,Smad7蛋白升高(P<0.05,P<0.01)。结论 GDFMD具有抗肝纤维化作用,其作用机制可能与调控TGF-β_1/Smad信号通路相关因子的基因与蛋白表达有关。

肝豆汤对tx小鼠肝脏微量元素含量及ATP7B蛋白表达的影响

目的探讨中药肝豆汤对肝豆状核变性(WD)动物模型tx小鼠肝脏微量元素铜、锌、铁代谢及ATP7B蛋白表达水平的影响。方法选择60只tx小鼠随机分为肝豆汤治疗组(n=25)和模型组(n=35),24只正常野生型DL小鼠为对照组。治疗组给予肝豆汤灌胃,模型组给予生理盐水灌胃,对照组仅常规饲养。检测各组小鼠不同月龄肝脏铜、锌、铁微量元素含量及肝组织ATP7B蛋白表达水平。微量元素检测采用原子吸收分光光度法;ATP7B蛋白表达水平分别采用免疫组化、Western blot法。结果模型组和治疗组较同月龄对照组肝脏铜含量明显升高(P均<0.01),但治疗组铜含量显著低于同月龄模型组(P均<0.01),模型组和治疗组在5月龄内均表现出随月龄增加铜含量增加(P均﹤0.01)。模型组锌含量较同月龄对照组升高,但与治疗组差异无统计学意义,同时治疗组较模型组锌含量升高与铜含量降低表现出方向一致性,但并不呈现线性相关。模型组铁含量较对照组偏高,治疗组较同月龄模型组铁含量下降(P<0.01,P<0.05)。ATP7B蛋白主要表达在细胞质。模型组ATP7B蛋白表达水平随月龄增加而上调,治疗组较同月龄模型组表达上调(P均<0.05)。结论肝豆汤可以降低tx小鼠肝脏细胞内铜含量,同时升高锌含量,降低铁含量;肝豆汤可上调ATP7B蛋白的表达,从而促进过量铜离子从胆汁中排出,减少铜的蓄积。