水稻基腐病细菌毒素的遗传特性和产毒相关的分子标记

【目的】水稻基腐病(Erwinia chrysanthemi pv.zeae)是水稻上重要的细菌病害之一,本论文对该病菌的毒素遗传特性和产毒相关的分子标记进行了研究。【方法】通过化学诱变方法,筛选基腐细菌去质粒的突变体Ech7-mu1;应用RAPD技术,筛选产毒素相关的分子标记。【结果】毒素活性测定结果表明,野生菌Ech7和去质粒菌株Ech7-mu1都能产生毒素。从260条随机引物中,筛选出引物K10,该引物能从不产生毒素的突变株Ech7-4中扩增出大小为2139bp的DNA特异片段,但不能扩增野生菌Ech7,将该片段克隆,测序分析,设计特异引物,在突变体Ech7-4中获得了与毒素产生相关的SCAR分子标记(标记符合率为100%)。该基因片段有5个ORFs,其中2个ORFs分别编码NADH-黄素还原酶和N-乙酰转移酶,另外2个不完整的ORFs编码的蛋白分别与Pseudomonas aerginosa(ZP00136947)和Yersinia Pestis(ZP01177873)的抗菌素代谢转运蛋白通透酶(DMT)具有66%和46%的同源率。【结论】水稻基腐细菌毒素的生物合成是由染色体基因编码,与质粒无关。不产生毒素的突变菌株基因突变的位点位于SCAR标记DNA的3′末端。

嗜杀酿酒酵母毒素蛋白及其杀伤质粒的研究

Killer toxin from \%Saccharomyces cerevisiae\% SK was isolated by ultrafiltration of culture supernatants and purified by poly(ethylene glycol). The toxin migrates as one single protein band on SDS-PAGE and its molecular weight is 15kD. The SK toxin has the greatest lethal effect on the sensitive yeast strain in the lat lag phase. Extraction and purification of killer heretity factor(dsRNA) from SK found that M dsRNA plasmid and L dsRNA plasmid have different molecular lengths being 1.7kb and 4.0kb.

抗鞘翅目δ-内毒素及毒素基因文库的构建

研究了对鞘翅目昆虫有毒效的5个苏云金芽孢杆菌新菌株YM-03、Sph04-04、YK14-01、SH11-05、Sph16-01伴孢晶体的蛋白质组成,以柳蓝叶甲为供试虫测定了它们的LC_(50)值,其中YM-03毒力最高。测定了YM-03晶体蛋白N-末端部分氨基酸序列。用琼脂糖凝胶电泳快速检测了5株菌的质粒组成,证明其质粒图型各不相同。以广谱的cosmid质粒pLAFRI为载体,通过限制酶EcoRI部分酶解获得“目的”DNA片段,构建了菌株YM-03的总DNA文库,对17个抗性克隆的质粒进行酶切分析表明,其中含有外源片段的克隆占总数的76％,超过要求的理论值。以人工合成的杀鞘翅目基因的18bp保守序列片段为探针,筛选了近1200个抗性克隆,获得了3个阳性克隆,LE392(PBYM2)、LE392(pBYM3)和LE392(pBYM4),毒力测定试验表明LE392(pBYM3)和LE392(pBYM4)有一定表达,表明其携带有δ-内毒素基因。

大肠杆菌不耐热肠毒素及其分子生物学

产肠毒素大肠杆菌是与腹泻相关的一类大肠杆菌 ,肠毒素可分为耐热肠毒素和不耐热肠毒素。文章从肠毒素免疫性与作用机理 ,不耐热肠毒素的基因质粒、定位、亚基因克隆及表达 。

嗜杀酵母的生物学功能及其应用

嗜杀酵母能够分泌毒素蛋白,杀死敏感酵母。嗜杀酵母对自身分泌的嗜杀毒素具有免疫力。嗜杀酵母的嗜杀特性与两种双链线状RNA(dsRNA)有关,即编码产生毒素蛋白的M-dsRNA和编码自身和M-dsRNA外壳蛋白的L-dsRNA。嗜杀毒素破坏细胞跨膜化学质子梯度,造成ATP和钾离子泄漏,导致细胞死亡。应用嗜杀酵母可避免野生型酵母污染,净化发酵体系,改善发酵产物品质;嗜杀毒素也可作为抵制病原酵母和类酵母微生物的抗真菌剂。

产气荚膜梭菌主要致死性毒素的研究进展

产气荚膜梭菌作为危害各国家畜养殖业的主要致病菌之一,受到国内外研究者的普遍关注。产气荚膜梭菌的主要致病因子是菌体产生的外毒素。近年来,国内外对其致病机理进行了深入研究,建立起简便、快速的检测方法,并且在防治手段方面取得了巨大突破。对产气荚膜梭菌的主要致死性毒素类型、致病机理、检测技术及其防治措施等方面的研究进展进行了阐述。

鼠疫菌质粒缺陷株的建立及66Mdal 质粒的功能

本文报道了应用吖啶黄诱变鼠疫菌获得了53株缺失66Mdal 质粒的鼠疫菌突变株。经反相间接血凝试验证实66Mdal 质粒决定 F1和 F2抗原(鼠毒素)的产生。

VT2-B亚单位的重组表达及单克隆抗体的制备

以大肠杆菌O157DNA为模板扩增VT2-B亚单位,纯化后经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切,连入表达载体pGEX4T-2,构建重组表达质粒pGEX4T-2-VT2-B。转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导,实现了VT2-B-GST融合蛋白的可溶性表达,表达量约占菌体总蛋白的35%。重组蛋白纯化后,免疫BALB/C小鼠制备单克隆抗体,得到2株融合细胞,制备了腹水单抗,测得单抗的ELISA效价为104。Western blot表明,该单抗能与重组蛋白特异性的结合。特异性单抗的获得为VT2毒素检测方法的建立奠定了基础。

变形链球菌pacA和gtfB-cat与ctxB嵌合表达质粒的构建及表达

目的:构建含变形链球菌表面蛋白A区编码基因(pacA)、葡糖基转移酶催化区编码基因(gtfB-cat)及霍乱毒素B亚单位编码基因(ctxB)的嵌合表达质粒并表达目的蛋白。方法:将目的基因pacA、gtfB-cat、ctxB克隆至原核克隆载体pET32-a(+)构建嵌合质粒pET-pacA-cat-ctxB,将其转入表达宿主菌E.coliBL21(DE3),并测量其表达情况。结果:构建的重组质粒经酶切、PCR鉴定及测序,证实目的基因均正确插入到载体pET-32a(+)中,插入的相位正确,未改变目的基因的阅读框架,经诱导后表达目的蛋白,分子质量大小与预期一致。结论:成功构建了嵌合质粒pET-pacA-cat-ctxB,且它们均在原核细胞内获得正确表达。

重组白喉毒素表达质粒H21G-his序列分析及改造研究

以源自国外的重组白喉毒素表达质粒H21G-h is为模板,利用PCR技术,扩增H21G-h is的基因并测定核苷酸序列,确证重组白喉毒素表达质粒H21G-h is的突变位点;对表达载体多克隆位点上下游的功能序列进行测定,确定组氨酸标签位置;在基于对载体正确分析的基础上,改造质粒,除去组氨酸标签,表达天然蛋白;利用pET表达系统重新构建新的非融合表达载体,并对表达量进行比较,为该蛋白作为载体用于多糖结合疫苗奠定基础。

含人乳癌DF3/MUC1启动子转录调控序列和白喉毒素A链基因表达载体的构建

目的:构建含人乳癌DF3/MUC1启动子转录调控序列和白喉毒素A链(DTA)基因的重组表达载体。方法:利用PCR技术从人乳癌细胞MCF7中扩增出DF3/MUC1启动子的转录调控序列并克隆入pMD18T载体中,再从pMD18T-DF3重组质粒中切下DF3/MUC1启动子的转录调控序列并亚克隆入pGL3Basic载体,构建重组质粒pGL3-DF3。从质粒pIBI30DTA中切下DTA片断,以DTA基因替换重组质粒pGL3-DF3中的虫荧光素酶基因,构建重组质粒pGL3DF3DTA。结果:构建了含人乳癌DF3/MUC1启动子转录调控序列和DTA的表达载体,酶切和测序结果与预期完全相符。结论:重组质粒pGL3-DF3-DTA构建成功。

应用CTB基因启动子及信号肽序列构建分泌性表达系统

利用霍乱毒素B亚基基因的启动子、信号肽序列及ctx操纵子的转录终止信号构建了分泌性表达的质粒载体pMC05S。β-半乳糖苷酶基因克隆至霍乱毒素B亚基基因的信号肽序列下游后能得到高效分泌性表达。不同的宿主菌和培养基成分中对β-半乳糖苷酶的表达产量有较大的影响,以MM2为宿主菌、在玉米浆培养基中β-半乳糖苷酶的表达产量达4100u/ml,产物的大部分分泌至细胞的周质;活力测定的结果与SDS-PAGE电泳测定结果基本一致,说明表达的β-半乳糖苷酶绝大部分都具有酶活性。构建的蛋白质分泌性表达的载体-宿主系统及合适的培养条件为易形成包含体的蛋白质的高效表达提供了一条新的途径。

Stx2A-LHRH重组质粒的构建及分析

目的 :表达志贺毒素 2 A-黄体生成激素释放激素 ( Stx2 A- LHRH)重组毒素 ,探讨其是否具有特异杀伤癌细胞的可能性。方法 :用 PCR方法扩增带有 Nco 和 Eco R 酶切位点的 Stx2 A-LHRH DNA基因 ,克隆至 p ET- 2 0 b( + )质粒中 ,转化大肠杆菌 BL2 1 ( DE3) ,挑取单菌落培养 ,提取质粒、酶切。结果 :经鉴定、测序 ,获得重组质粒 p ET2 0 - SL。结论 :利用分子生物学技术成功地构建了带有 Stx2 A- LHRH重组毒素基因的质粒 ,使其表达 Stx2 A- LHRH重组毒素成为可能 ,为进一步研究导向药物奠定了基础。

重组质粒PGL3-DF3-DTA对乳腺癌荷瘤裸鼠的治疗研究

目的探讨重组质粒PGL3-DF3-DTA对乳腺癌移植模型的治疗作用。方法裸鼠皮下接种MCF-7人乳腺癌细胞,建立人乳腺癌移植模型。用质粒PGL3-DF3-DTA,质粒PGL3-DF3和生理盐水分别给裸鼠移植瘤瘤内多点注射。观察肿瘤大小和组织形态学变化,并用流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡改变。结果重组质粒PGL3-DF3-DTA组裸鼠乳腺癌生长受到明显抑制,抑制率为50.08%,肿瘤细胞的凋亡率增加。结论重组质粒PGL3-DF3-DTA对裸鼠人乳腺癌移植瘤的生长具有明显抑制作用,为乳腺癌基因治疗提供了新的方法。

CT-1及TTC的GST融合蛋白表达质粒的构建及表达

目的构建心肌营养素-1(CT-1)和破伤风外毒素C片段(TTC)重组融合蛋白表达质粒。方法利用PCR、TA克隆等技术将CT-1及TTC基因克隆并连接到pGEX-4T-3,再做酶切鉴定、序列测定。在不同温度不同时间,通过IPTG诱导pGEX-CT-1/TTC在DH5α大肠杆菌中表达,SDS-PAGE分析表达量和可溶性蛋白GST-CT-1/TTC比例。结果构建的pGEX-CT-1/TTC酶切结果可见606 bp1、356 bp大小的片段,与预期结果一致,测序结果表明序列正确。通过IPTG诱导,发现35℃诱导4 h,目的蛋白GST-CT-1/TTC表达量占全菌的1/5,可溶性蛋白与包涵体比为2/5。结论本实验成功构建了pGEX-CT-1/TTC重组融合质粒,为下一步将其用于脊髓损伤的治疗研究打下了基础。

酿酒酵母两种不同嗜杀菌株的比较研究

以酿酒酵母两种不同类型的嗜杀菌株SK4（K1型）和ERRI（K2型）为材料，分析了不同嗜杀酵母的嗜杀特性，两株嗜杀酵母具有相互杀死作用，其嗜杀活性与菌体生长有关。SK4和ERRI的嗜杀质粒的比较表明：M1－dsRNA质粒和M2-dsRNA质粒分子量分别为1．7kb和1．5kb，两株菌的L－dsRNA质粒均为4．0kb。用高温和紫外线处理嗜杀酵母，嗜杀活性随之消失，消除菌中的M－dsRNA质粒也相应消失，嗜杀活性的消除率随菌株和消除剂的不同而变化。实验证明两株菌产生的毒素蛋白的最适嗜杀作用条件不同，最适pH和温度分别为4．8、16℃和4．0、22℃，但两种毒素蛋白均对在对数生长期的敏感细胞作用最显著。

进口南美白对虾亲虾急性肝胰腺坏死病的检测分析

急性肝胰腺坏死病(AHPND)是一种新发疫病,对对虾养殖业损失巨大。其病原是携带毒素质粒基因的副溶血弧菌,但具体致病机制仍不清楚。本研究利用国外报道的毒素质粒基因特异性引物,对一批进境南美白对虾亲虾进行了AHPND检测。因其PCR的扩增结果与国外所报道的基因片段一致,初步认定为AHPND阳性。本文对此次检测的结果和过程进行了分析,为我国AHPND的检测提供了分析数据。

重组CD13单链抗体/蝎毒素AGAP原核表达质粒的构建

目的:构建pRSETA/AGAP/CD13scFv重组表达质粒,为重组CD13单链抗体/蝎毒素AGAP融合蛋白的表达奠定实验基础。方法:利用RT-PCR法从东亚钳蝎尾腺中获得AGAP目的基因,并与克隆质粒TOPO载体连接转入DH5α菌,用EcoR I和Hind III将目的基因从克隆质粒上切下并与同样双酶切后的表达质粒pRSETA连接;在含CD13单链抗体(CD13scFv)的pSecTag2HygroC/CD13-1/RFP质粒中获得CD13scFv目的基因,用EcoR I、Xho I双酶切并与同样双酶切后的pRSETA/AGAP连接转入DH5α菌,提取重组质粒进行酶切及测序鉴定。结果:目的基因AGAP与表达质粒pRSETA连接,成功构建了pRSETA/AGAP重组质粒;目的基因CD13scFv再与该重组质粒连接,成功构建了pRSETA/AGAP/CD13scFv。结论:AGAP目的基因能经RT-PCR法获得,并能成功与表达质粒连接,构建pRSETA/AGAP;目的基因CD13scFv能由pSecTag2HygroC质粒中获得,并成功与pRSETA/AGAP连接,得pRSETA/AGAP/CD13scFv重组质粒。为该重组质粒体外融合蛋白的表达及今后研究CD13scFv和蝎毒素AGAP协同性杀伤CD13阳性肿瘤细胞提供了良好的实验基础及理论依据。

人源与牛源非O157产志贺毒素大肠杆菌耐药性分析及脉冲场凝胶电泳分子分型

为了解人源和牛源非O157产志贺毒素大肠杆菌(STEC)的耐药表型、耐药基因、质粒复制子类型及其之间的同源性,本研究采用K-B纸片法对3株人源非O157 STEC和14株牛源非O157 STEC耐药株进行药敏试验,结果显示3株人源非O157 STEC均耐药,其中2株呈多重耐药(MDR);14株牛源非O157 STEC耐药株中有9株呈MDR。11株MDR-非O157 STEC对4~13种抗生素耐药,包括β-内酰胺类、四环素类、磺胺类、氯霉素类和氨基糖苷类药物,其中10株(1株人源和9株牛源)非O157 STEC的耐药谱中出现氯霉素-链霉素-复方新诺明-四环素组合。通过PCR方法检测非O157 STEC耐药基因floR(氯霉素类)、mph(A)(大环内酯类)、strA、strB(氨基糖苷类)、sulR(磺胺类)和tet(A)、tet(G)(四环素类)和质粒复制子分型,结果显示17株非O157 STEC中有7株携带floR-mph(A)strA-strB-sulR-tet(A)-tet(G),2株携带floR-strA-strB-sulR-tet(A)-tet(G),2株携带tet(A)-tet(G),1株携带floR-mph(A)-tet(A)-tet(G),1株携带floR-mph(A),4株未携带检测的耐药基因;质粒复制子分型显示,IncFIB质粒检测率最高为82%(14/17),IncC和IncW质粒次之(47%,8/17)。通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)对人源和牛源非O157 STEC耐药株进行同源性分析,结果显示,人源与牛源非O157 STEC耐药株的相似度低于80%。本研究上述结果表明人源和牛源非O157 STEC均出现了MDR,同源性不高,但这些菌株携带多个耐药基因和质粒,且呈现相似的耐药模式,并且本研究首次在我国新疆地区非O157 STEC中检测出mph(A)基因,提示在动物生产中需谨慎用药,以防止同时具有耐药性和毒力的菌株感染人类。

蜡样芽胞杆菌族毒素研究进展

蜡样芽胞杆菌族(Bacillus cereus sensu lato)包括几个具有密切系统发育关系的芽胞杆菌物种,产生的毒素种类繁多,备受人们关注。质粒在菌株中的水平转移,会改变其表型、致病性和毒力,同时也带来分类的问题。通过综述几种蜡样芽胞杆菌毒素的结构特性、作用机制及其危害或生物应用,从质粒水平转移的角度介绍蜡样芽胞杆菌族成员错综复杂的关系。