TPP背景下基因药品专利池之构建、管理与运行

伴随着"药厂友好型"之TPP协定的达成和基因制药产业的飞速发展,药品专利与公共健康的矛盾日益突出,基因药品专利池作为化解这一矛盾的有效措施应运而生。日益严重的专利丛林现象与反公有地悲剧是基因药品专利池产生的动因,TPP影响下不断加剧的技术垄断风险与抑制创新危机则是基因药品专利池构建的困境;因而,有必要从区分专利类型与设立技术标准和遴选必要专利与明确价值取向两个步骤来实现基因药品专利池的高效管理,并采用多元化的许可机制来确保基因药品专利池的良好运行。

条斑紫菜TPS基因TPP结构域的缺失突变

条斑紫菜6-磷酸海藻糖合成酶(TPS)基因(PyTPS)具有TPS及TPP双结构域,以该基因的原核表达载体pET22b-PyTPS为材料,利用双酶切片段替换法对该基因TPP结构域磷酸酶基序的编码框Box1与Box2进行了缺失突变。第一,用715bp缺失Box1的KpnI-EcoRI人工合成片段替换pET22b-PyTPS中相应的片段,获得了缺失Box1的突变基因PyTPS-Box1。第二,用661bp缺失Box2的EcoRI-HindII片段进行替换,获得了缺失Box2的突变基因PyTPS-Box2。第三,在缺失Box1后,再通过替换缺失Box2,获得了同时缺失Box1与Box2的突变基因PyTPS-Box1-Box2。本研究既获得了三种突变基因,又获得了其原核表达载体,为研究PyTPS基因的编码活性提供了材料,奠定了基础。

华癸中慢生根瘤菌焦磷酸硫胺素结合蛋白基因tpp的功能研究

在构建M.huakuii tpp基因突变株的基础上,通过自生生长和植物盆栽试验,研究焦磷酸硫胺素结合蛋白tpp基因在根瘤菌的生长及与紫云英宿主共生固氮过程中的功能。通过同源重组获得华癸中慢生根瘤菌tpp突变菌株HKtpp,并进一步研究tpp基因突变对菌株生长及共生固氮功能的影响。结果显示:tpp基因突变会减缓菌株生长,突变菌株胞内的谷胱甘肽还原酶活性显著降低。植物盆栽试验表明,突变菌株感染紫云英宿主形成有效的红色根瘤,但是其固氮酶活降低了26.4%。结果表明:tpp基因在根瘤菌的生长和共生固氮中发挥着重要作用。

一种小粒径壳聚糖纳米粒作为基因载体的研究

系统比较了不同分子量的壳聚糖与TPP离子交联制备的纳米粒,用于基因转运载体,评价其对质粒和siRNA的转运效果。通过粒度仪测定壳聚糖纳米粒(CSNPs)的粒径、多分散系数以及Zeta电位;透射电镜观察CSNPs的形态;MTT法测定其细胞毒性;通过CSNPs在小鼠肌肉内的组织切片观察其生物相容性。CSNPs分别包载质粒和siRNA,凝胶电泳和分光光度法测定其包载能力,荧光显微镜、激光共聚焦或流式细胞术分析其对肿瘤细胞的转染效果;溶血实验和血凝实验分析其血液相容性。结果表明,1 mg/mL的CS(160 k Da)和TPP(质量比为10∶1)制备的CSNPs粒径约100 nm,且分布均一、稳定,透射电镜下为形态规则的类球型粒子;其细胞毒性均在0~1级,符合生物医用材料毒性标准;组织切片没有发现明显的炎症反应,生物相容性良好;CSNPs对质粒和siRNA的包载率较高,并能成功将其转运至细胞内,但小粒径的纳米粒转染质粒后荧光较弱,而携带siRNA的CSNPs转染后荧光较强,且流式细胞术结果表明其与商品化转染试剂相比转染率较高;溶血及血凝实验也发现材料具有良好的血液相容性。所以,制备的小粒径CSNPs更适合作为一种安全高效的siRNA转运载体,后续可以加以修饰应用于肿瘤的基因靶向治疗中。

玉米TPP家族基因生物信息学及表达分析

TPP是合成海藻糖的关键酶,广泛存在于各种植株中,可通过影响海藻糖的合成参与调控植株的抗逆体系。分析玉米中TPP家族基因的性质和进化有利于进一步为玉米在逆境中的产量品质提高的研究奠定基础。本研究利用拟南芥的9个TPP家族基因,结合BLAST、Pfam、ExPASy、MEGA 6.0、MEME、TBtools等软件和网站,对玉米TPP家族成员的基因位置、基因结构、蛋白质理化性质、保守基序、系统进化和基因表达模式进行分析。结果显示,根据B73的完整基因组数据,在玉米基因组中共鉴定了26个TPP基因,氨基酸数介于243和1 391之间,均为亲水性蛋白,且64.5%的成员属酸性蛋白。除第10号染色体外,玉米TPP家族基因在其余染色体上均有分布。鉴定了3个保守结构域,结合基因进化和基因结构分析,具有相同motif的基因在进化和基因结构上相对一致。根据基因启动子顺式作用元件分析,ZmTPP11可能与提高植株低温抗性有关,ZmTPP15可能与加速玉米机械损伤愈合有关。通过对玉米TPP基因表达模式分析,发现有5个TPP基因在各组织和发育时期均高表达,而共表达分析和GO富集分析显示与ZmTPPs共表达的基因主要参与应激反应、信号传导、发育过程和生物调节等生物过程。研究结果为进一步研究玉米对逆境胁迫的响应和生长发育提供参考。