华癸中慢生根瘤菌焦磷酸硫胺素结合蛋白基因tpp的功能研究

在构建M.huakuii tpp基因突变株的基础上,通过自生生长和植物盆栽试验,研究焦磷酸硫胺素结合蛋白tpp基因在根瘤菌的生长及与紫云英宿主共生固氮过程中的功能。通过同源重组获得华癸中慢生根瘤菌tpp突变菌株HKtpp,并进一步研究tpp基因突变对菌株生长及共生固氮功能的影响。结果显示:tpp基因突变会减缓菌株生长,突变菌株胞内的谷胱甘肽还原酶活性显著降低。植物盆栽试验表明,突变菌株感染紫云英宿主形成有效的红色根瘤,但是其固氮酶活降低了26.4%。结果表明:tpp基因在根瘤菌的生长和共生固氮中发挥着重要作用。

TPP1基因慢病毒干扰载体的构建及鉴定

目的:构建抑制TPP1基因的短发夹RNA(sh RNA)干扰载体。方法:以人的TPP1基因为靶序列,设计并合成sh RNA序列TPP1-si1和TPP1-si2,分别与RNA干扰慢病毒载体pll3.7连接,双酶切鉴定质粒得到阳性克隆pll-TPP1-si1和pll-TPP1-si2,经测序正确后将其与慢病毒包装载体(RRE、REV、VSVG)共转染293T细胞,进行病毒的包装,将得到的病毒感染稳定高表达外源TPP1蛋白的HT1080细胞,通过Western印迹检测其对TPP1蛋白表达的抑制效果,并进行比较;将抑制效果好的病毒感染高表达外源Pot1蛋白的Hep G2细胞,检测Pot1蛋白在内源TPP1被敲低的情况下能否在端粒定位。结果:经双酶切验证,外源片段成功插入载体pll-TPP1-si1和pll-TPP1-si2中;pll-TPP1-si1和pll-TPP1-si2均能明显抑制TPP1的表达,其中pll-TPP1-si1的抑制效果最好;pll-TPP1-si1病毒感染高表达外源Pot1蛋白的Hep G2细胞,经免疫荧光鉴定能够有效抑制内源TPP1的表达,使Pot1不再端粒定位。结论:构建的抑制TPP1基因的sh RNA干扰载体能有效抑制TPP1的表达,为端粒蛋白TPP1功能的研究奠定了实验基础。

基于基因检测诊断晚婴型神经元蜡样脂褐质沉积症1例

对1例晚婴型神经元蜡样脂褐质沉积症(LINCL)患儿进行临床诊断和遗传学分析。该患儿TPP1存在c.1424C>T(p.Ser475Leu)和c.962A>G(p.His321Arg)复合杂合突变,分别遗传其父亲和母亲,突变致病性分析均为有害和致病,蛋白序列同源性比对中同源区域均为高度保守。患儿可能是由TPP1复合杂合突变导致的晚婴型神经元蜡样脂褐质沉积症,其中c.962A>G(p.His321Arg)位点突变尚未见报道,新突变基因的发现扩大了该基因的突变谱,为阐明LINCL遗传机制提供线索和方向。全外显子组测序技术(WES)可作为发现LINCL的诊断手段,可为临床表型复杂的疾病确诊提供依据。

玉米TPP家族基因生物信息学及表达分析

TPP是合成海藻糖的关键酶,广泛存在于各种植株中,可通过影响海藻糖的合成参与调控植株的抗逆体系。分析玉米中TPP家族基因的性质和进化有利于进一步为玉米在逆境中的产量品质提高的研究奠定基础。本研究利用拟南芥的9个TPP家族基因,结合BLAST、Pfam、ExPASy、MEGA 6.0、MEME、TBtools等软件和网站,对玉米TPP家族成员的基因位置、基因结构、蛋白质理化性质、保守基序、系统进化和基因表达模式进行分析。结果显示,根据B73的完整基因组数据,在玉米基因组中共鉴定了26个TPP基因,氨基酸数介于243和1 391之间,均为亲水性蛋白,且64.5%的成员属酸性蛋白。除第10号染色体外,玉米TPP家族基因在其余染色体上均有分布。鉴定了3个保守结构域,结合基因进化和基因结构分析,具有相同motif的基因在进化和基因结构上相对一致。根据基因启动子顺式作用元件分析,ZmTPP11可能与提高植株低温抗性有关,ZmTPP15可能与加速玉米机械损伤愈合有关。通过对玉米TPP基因表达模式分析,发现有5个TPP基因在各组织和发育时期均高表达,而共表达分析和GO富集分析显示与ZmTPPs共表达的基因主要参与应激反应、信号传导、发育过程和生物调节等生物过程。研究结果为进一步研究玉米对逆境胁迫的响应和生长发育提供参考。

神经元蜡样质脂褐质沉积症2型一家系临床表型及三肽基肽酶-1基因突变分析

目的总结经二代测序确诊的神经元蜡样质脂褐质沉积症2型(CLN2)一家系的临床表型及三肽基肽酶-1(TPP1)基因突变特点。方法收集2018年6月就诊于郑州大学附属儿童医院神经内科的CLN2一家系的临床资料,采用二代测序方法对先证者进行全外显子测序,并对家系成员进行一代Sanger验证及致病TPP1基因突变特点分析,总结临床特征。结果先证者为3岁9个月女童,主要临床表现为全面性强直-阵挛性癫痫发作,智力正常,语言、运动轻度发育落后,眼科检查示双眼屈光不正,视力正常,无黄斑变性。头颅磁共振成像(MRI)示额颞部蛛网膜下腔增宽、脑沟加深,小脑萎缩。TPP1基因存在复合杂合突变,来自表型正常的父母,其中c.1449-1450insG(p.I484Dfs*7)来源于父亲,为未报道的移码杂合突变,c.1417G>A(p.G473R)来源于母亲,为已知致病的错义突变,符合CLN2复合杂合突变常隐致病特点。先证者同胞哥哥3岁起病,首发症状为肌阵挛癫痫发作,现7岁伴随进行性视力障碍及智力、运动、认知功能倒退,眼科检查发现视网膜变性,头颅MRI提示全脑性萎缩,小脑萎缩明显。TPP1致病基因及复合杂合突变位点均与先证者一致。现2岁10个月弟弟表型正常,为c.1417G>A(p.G473R)单一杂合突变,来源于母亲,先证者父母均无临床表型。结论CLN2是一种罕见的溶酶体贮积症,属于神经退行性疾病之一,主要临床特征为癫痫发作,进行性智力、运动倒退,视力丧失,头颅MRI提示脑萎缩,双眼黄斑变性,TPP1基因复合杂合突变c.1449-1450insG(p.I484Dfs*7)及c.1417G>A(p.G473R)是本例患儿的遗传学病因。