绵羊TRA2B基因的克隆、序列信息与表达分析

旨在研究绵羊TRA2B基因的结构与功能,探讨其在两品种脂尾型绵羊脂肪等不同组织中的表达和调控特性。采用RT-PCR克隆TRA2B基因编码区(CDS)并对其进行生物信息学分析;Real-time PCR检测广灵大尾羊和小尾寒羊8月龄公羊共8只心、肝、肾、小肠、睾丸、肾周及尾脂肪组织、股二头肌中TRA2B基因mRNA的表达。结果表明,TRA2B基因CDS区长867bp,编码288个氨基酸。生物信息学分析表明,TRA2B为不稳定的水溶性蛋白,无信号肽和跨膜域,有2个O-糖基化位点和70个磷酸化位点,109~196氨基酸残基为RRM保守结构域。TRA2B基因mRNA在所检测的组织中均有一定的表达,睾丸中表达量最高,显著高于肾、肾周脂肪与尾脂(P<0.05)以及肝、股二头肌和小肠中的表达量(P<0.05),心中表达量最低(P<0.05)。品种间总mRNA表达量差异不显著(P>0.05),品种因素显著影响该基因组织间的表达(P<0.05)。TRA2B可能在绵羊繁殖及脂质代谢中发挥重要作用。为深入研究TRA2B在绵羊中的基因功能提供了理论基础。

前体mRNA剪辑蛋白Tra2基因在神经组织中的表达特征发育调控策略研究

目的分析前体mRNA剪辑蛋白Tra2基因在神经组织中的表达特征发育调控策略。方法使用自制Tra2α1抗血清以及Tra2β蛋白的RA301血清,对不同时期的人类胚胎组织中Tra2蛋白加以检测。分析相关结果。结果从11-16周,Tra2β1蛋白在心脏和肺脏内表达量上升。在11周,Tra2α1在脊髓,延髓和小脑内有表达趋势,肾脏和心脏亦有表达,其余组织无表达。16周,在11周,Tra2α1在神经组织内依然为高水平表达。心脏少量表达,其余组织无表达。结论 Tra2蛋白可经过多方式对某些特异性基因前体mRNA剪辑,对生长发育起到调控作用,心脏以及神经组织的发育依赖于Tra2α1蛋白的调节功能,在11周内,Tra2α1蛋白的剪辑调节功能对于肾脏的发育也存在一定作用。

中华卵索线虫tra-1基因cDNA片段的克隆及实时定量表达分析

利用RT-PCR和3′-RACE,从中华卵索线虫Ovomermis sinensis中获得tra-1基因cDNA部分序列,该序列长800bp,共编码195个氨基酸,与GLI转录因子家族其它成员在锌指区域具有较高的相似性(70%～77%)。实时荧光定量检测显示:雌成虫tra-1相对表达量最高,与其它虫期差异极显著(P<0.01),在怀卵雌虫和胚胎发育期卵中,tra-1相对表达量明显下降,但仍显著高于其它试验组(P<0.05);其它试验组,即感染期幼虫、1～6天寄生期幼虫、寄生后期幼虫与雄成虫之间表达量无明显差异(P>0.05)。线虫在宿主体内不同的感染强度(40/1与10/1)对tra-1基因转录活性无显著影响(P>0.05)。表明tra-1基因参与调控中华卵索线虫雌性生殖系统的发育、卵的形成以及胚胎的发育。

核蛋白H-NS调控多重耐药鸡大肠埃希菌IncFⅡ质粒接合转移的分子机制

【目的】以临床分离的多重耐药鸡大肠埃希菌IncFⅡ质粒为研究对象,探究核蛋白H-NS调控其接合转移的分子机制,为控制IncFⅡ质粒介导的多重耐药基因水平散播提供理论依据。【方法】测定大肠埃希菌ATCC25922及4株重组菌(pBAD25922、F25922、FΔhns和FΔhns/phns)的生长曲线,比较hns对菌株的影响情况;分别以F25922、FΔhns和FΔhns/phns为供体菌,大肠埃希菌J53(耐叠氮钠)为受体菌,进行接合试验,并计算接合频率;采用实时荧光定量PCR检测各重组菌(F25922、FΔhns和FΔhns/phns)中IncFⅡ质粒接合转移相关基因(traM、traJ和traY)的mRNA表达量;构建LacZ融合报告菌株F25922/P_(M)(P_(J)/P_(Y))、FΔhns/P_(M)(P_(J)/P_(Y))和FΔhns/phns/P_(M)(P_(J)/P_(Y)),分别测定不同菌株中3种基因(traM、traJ和traY)启动子P_(M)、P_(J)和P_(Y)的β-半乳糖苷酶活性;构建H-NS蛋白原核表达载体,采用镍离子亲和层析法分离纯化H-NS核蛋白,PCR扩增并纯化3种基因启动子区的DNA序列,利用电泳迁移率变动分析试验(EMSA)探明核蛋白H-NS调控IncFⅡ质粒接合作用的调控方式,预测H-NS与不同启动子的结合位点并用EMSA进行进一步验证。【结果】重组菌F25922和pBAD25922与大肠埃希菌ATCC25922的生长状况无明显差异,说明质粒pBAD和IncFⅡ均不影响宿主菌大肠埃希菌ATCC25922的生长;但是,缺失重组菌FΔhns和缺失回补重组菌FΔhns/phns的生长速度明显低于大肠埃希菌ATCC25922,表明hns的缺失导致菌株的生长适应性变差,但不影响菌株的存活。接合试验结果显示,FΔhns中IncFⅡ质粒的接合频率较对照菌F25922升高了1279.33倍(P<0.001),而FΔhns/phns中IncFⅡ质粒的接合频率虽未完全恢复到对照菌株的水平,但也明显低于FΔhns。实时荧光定量PCR结果显示,FΔhns中tra基因(traM、traJ和traY)的mRNA表达量均极显著高于对照菌株(P<0.001),其中traJ的mRNA表达量最高,为F25922的1510.14倍,其次为traY和traM,表达量分别为F25922的448.14倍和81.54倍,而回补株FΔhns/phns中不同基因的mRNA表达量均极显著低于FΔhns,与对照菌相类似。β-半乳糖苷酶活性测定结果显示,缺失报告菌株FΔhns/P_(M)(P_(J)/P_(Y))中P_(M)、P_(J)和P_(Y)的β-半乳糖苷酶活性分别为5.66,10.45和21.91,均极显著高于对照菌F25922/P_(M)(P_(J)/P_(Y))的相应启动子(P<0.001),而回补报告菌株FΔhns/phns/P_(M)(P_(J)/P_(Y))中P_(M)、P_(J)和P_(Y)的β-半乳糖苷酶活性极显著低于FΔhns/P_(M)(P_(J)/P_(Y)),且均与对照菌株无明显差异。这些结果均表明hns对IncFⅡ质粒接合转移呈明显的负调控作用。EMSA结果显示,H-NS核蛋白均能明显阻滞3个tra基因启动子DNA的迁移,说明H-NS可直接与tra基因的3个启动子区结合;通过对结合位点的预测和EMSA进一步验证,证实H-NS核蛋白可与3个启动子区的AT富集区结合。【结论】H-NS核蛋白通过直接与IncFⅡ质粒的traM、traJ和traY的启动子区的AT富集区结合,抑制启动子活性,从而导致启动子下游相关转移基因traM、traJ和traY的表达量下降,结果明显抑制IncFⅡ质粒的接合转移。