Cis-AT和Trans-AT聚酮合酶及其特殊功能域研究进展

聚酮合酶(Polyketide synthase,PKS)是产生聚酮化合物的模块化复合酶,聚酮合酶能产生数量众多并具有生物活性的聚酮类天然产物。近年来一类与cis-AT聚酮合酶存在较大差异的trans-AT聚酮合酶被广泛研究。文章介绍cis-AT聚酮合酶与trans-AT聚酮合酶区别及trans-AT聚酮合酶基因簇中特殊功能域研究进展,展望利用功能域改造基因簇研究方向,以期为天然产物改造提供新靶点。

细菌聚酮合酶间的杂合方式及聚酮化合物生物合成逻辑

聚酮化合物(polyketide)是一类来源广泛、结构多样的活性天然产物,聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)负责聚酮骨架的生物合成。细菌次级代谢中PKS广泛存在,不同类型的PKS在组成和生物合成机制上各不相同,从而产生截然不同的聚酮骨架。根据细菌PKS功能和生物合成途径的不同,可以将其分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。PKS通常能与其他生物合成酶系杂合以产生结构更为复杂的天然产物。同时,不同类型PKS之间也可以形成多种内部杂合,产生更多样的聚酮骨架。本文总结和比较PKS间的内部杂合,包括Ⅰ型PKS内部杂合、Ⅰ型/Ⅱ型PKS杂合以及Ⅰ型/Ⅲ型PKS杂合,归纳各种杂合基因簇的形成方式及其杂合特征。通过比较杂合聚酮化合物的生物合成机制并讨论杂合聚酮工程化改造的进展,展望了多种潜在的聚酮杂合模式,合理假设存在合成过程相反的Ⅰ型/Ⅱ型PKS杂合模式,或随着化合物的挖掘发现迄今未报道的Ⅱ型/Ⅲ型PKS杂合模式等,指出可以充分和全面地利用细菌基因组信息,通过酶和基因的生物勘探,发现更多更特殊的PKS杂合化合物等一系列针对新颖聚酮化合物进行基因组挖掘的方向,同时也提出了工程化改造trans-AT PKS在cis-AT模块中实现不同寻常的骨架修饰等多种PKS的工程化改造设想,为后续PKS内部杂合基因簇挖掘和表征提供一些新思路。

聚酮化合物非天然延伸单元的生物合成与结构改造应用

聚酮天然产物包括10000多种具有广泛生物活性的分子,是获批临床药物中最著名的类别之一。已知活性先导化合物通常需要经过结构修饰改良其吸收、分布、代谢和排泄等特性,从而促进成药开发,但针对聚酮化合物的结构修饰极具挑战,需要应对聚酮骨架中大量的立体中心以及多个惰性碳原子,导致化学合成手段难以对聚酮骨架进行精准和高效的衍生化,因此,通过合成生物学方法实现其结构优化就成为了研究者们关注的热点。自然界中,绝大多数聚酮化合物主要由简单的乙酸盐和丙酸盐结构单元通过聚酮合酶组装而成,而少数存在的具有特殊结构单元的聚酮案例给了研究者以灵感——通过设置和引入非天然结构单元从而有选择性地高效改造聚酮结构。聚酮骨架的生物合成有赖于一个起始单元与多个延伸单元的组装,因此,通过人工设计延伸单元向聚酮引入预期结构被认为是精准高效改造聚酮的有力突破点。本文在此总结了近十年来报道的聚酮非天然延伸单元的三种重要的酶促合成方法,通过挖掘新颖的延伸单元合成酶并探索其底物宽泛性,或利用酶工程手段改造延伸单元合成酶的底物催化范围,获得了大量自然界不存在的延伸单元。此外,本文还归纳了利用非天然延伸单元对聚酮结构进行改造的案例,借助聚酮的天然合成途径或利用改造的合成途径达到预期目的。最后,作者讨论了该研究领域内存在的一些制约因素以及可优化的研究方向,包括聚酮合酶对非天然延伸单元的兼容性问题、非天然延伸单元的前体供给等。近年来,利用非天然延伸单元改造聚酮结构的研究兴趣和热度日益高涨,本文绘制了一份基于延伸单元改造聚酮结构研究的简明清晰的图谱,期望为加速聚酮类药物的高效开发打下坚实基础。

海洋链霉菌酮合成酶结构域基因的克隆及分析

海洋链霉菌通过聚酮合酶(PKS)合成许多结构和功能多样且具有药用价值的聚酮化合物(PKs),酮合成酶结构域(KS)作为PKS的核心结构域,可催化底物与伸长的聚酮之间的脱羧缩合,在聚酮化合物生物合成中起着重要作用。本文通过对从海洋链霉菌Streptomyces sp.X66基因组DNA克隆获得的ks基因的生物信息学分析表明,该ks基因序列长945 bp,BLAST序列比对显示其具有典型的酮合酶结构域的功能区域。理化分析显示其拟编码309个氨基酸,理论等电点为6.60,原子组成为C1401H2239N425O419S8,不稳定指数为42.11,平均亲水系数为0.112,编码产物为酸性疏水不稳定蛋白,且不含信号肽和跨膜结构,二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主,SDS-PAGE显示其分子量约为55 kDa。通过对ks基因的研究,为进一步解析聚酮化合物合成代谢中的调控机制及组合生物学和体外酶系合成聚酮化合物提供参考。

聚酮合酶的催化机制及聚酮类化合物的组合生物合成

聚酮类化合物(polyketides,PKs)是一类来源广泛、数目庞大的天然产物。聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)负责催化PKs的生物合成,是具有模块化结构的多功能复合酶,由一系列对称或非对称的二聚体模块组成。模块按照其功能的不同,可分为加载模块、延伸模块、卸载模块。各个模块中含有多个催化域,不同的催化域在聚酮链延伸过程中扮演着不同角色。模块以首尾相连的方式排列,通过非结构多肽接头或离散的对接结构域彼此连接,形成装配线来生产PKs。PKSs按照结构域和催化机制的不同,可以分为合成大环内酯类抗生素的I型PKSs(由迭代化PKSs和模块化PKSs组成)、合成芳香族聚酮类化合物的II型PKSs(也被叫做迭代类PKSs)和合成类黄酮化合物的III型PKSs。利用组合生物合成方法,如对不同聚酮物质或同一物质的不同结构域或模块进行交换,以及特异性地插入、替代、缺失关键基因,或者通过点突变等操作,可以形成重组PKSs,进而改变聚酮类化合物的结构。选择不同的起始和延伸单元,引入不同类型的PKSs后修饰酶以及对PKSs后修饰酶基因进行改造等方法,均可用于合成非天然PKs。本文概述了3大类型聚酮合酶的结构、催化机制和组合生物合成近期研究进展,为今后合理设计产量高、效价高、化学性质稳定的新型聚酮类化合物提供参考依据。

聚酮合酶基因岛在肺炎克雷伯菌临床分离株中的流行研究

目的 研究肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)的聚酮合酶(PKS)基因岛的临床分布情况,探讨PKS基因岛与肺炎克雷伯菌感染的关系。方法 收集234株肺炎克雷伯菌,根据有、无PKS基因岛分为PKS+组和PKS-组。采用聚合酶链式反应(PCR)检测PKS基因岛,并结合肺炎克雷伯菌感染患者的临床资料,分析其在临床样本中的分布情况。结果 234例感染者中,PKS+组感染者占37.6%(88/234)。菌株主要来源于痰液(70.1%,164/234)、血液(7.3%,17/234)、腹水(5.6%,13/234)和脓液(4.3%,10/234)。PKS+菌株感染者中患有肝脓肿的比例较PKS-菌株感染者多[(13.6%,12/88)vs(1.4%,2/146),P<0.001]。药敏实验发现,PKS+菌株在氨曲南、亚胺培南、美罗培南、阿米卡星、妥布霉素、环丙沙星、左氧氟沙星和复方新诺明的药物敏感性更高(P<0.001)。结论 PKS+感染者数量有进一步上升的趋势,肝病患者更易感染PKS+肺炎克雷伯菌,而PKS+菌株对多种抗生素的敏感性较PKS-菌株高。应高度重视PKS基因在肺炎克雷伯菌流行的可能性,并进一步发掘PKS基因在肺炎克雷伯菌感染中的诊疗价值。

新型聚酮合酶基因簇的分离与部分鉴定

目的从海洋沉积物中分离新型聚酮合酶(PKS)基因簇,并解析其基因结构,为研究PKS的组合生物合成提供新组件。方法采集中国东海沉积物样本,并提取宏基因组DNA,以其为模板,通过简并PCR扩增新型PKS片段,用地高辛标记正确的扩增片段作为探针,然后从本研究中构建的海洋沉积物样本Fosmid宏基因组文库中筛选完整基因簇,测序、结构分析。结果(1)所分离得到的海洋沉积物宏基因组DNA可直接作为PCR模板,简并PCR扩增得到26个新型KS编码片段,并成功提交GenBank;(2)所得DNA构建成滴度约5×108cfu/ml的Fosmid文库,插入片段平均长度约为40kb;(3)将其中的一个KS片段(GenBank登录号DQ942531)用地高辛标记并筛选部分文库,得到4个克隆,测序得到7981bp的序列(GenBank登录号EF568935),结构分析发现含典型的I型PKS组件,如酮缩酶(KS)、酰基转移酶(AT)、酰基载体蛋白(ACP)等。结论简并引物扩增、宏基因组文库筛选、测序、结构分析,在本研究中被证明是有效的分离新PKS基因簇的途径;通过系统进化树分析得出26条新KS片段属于Ⅰ型KS片断和杂合PKS/NRPS基因簇,主要来自放线菌门、δ变形菌门、蓝藻门和β变形菌门的微生物。

利玛原甲藻中聚酮合酶基因克隆与分析

为探讨聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)基因与藻毒素合成的关系,揭示PKS基因在赤潮毒素合成中的作用,采用兼并引物,通过PCR技术获得利玛原甲藻(Prorocentrum lima)可能存在的I型PKS基因;并对所获得PKS基因的同源性进行了分析,构建了基于PKS氨基酸序列的系统进化树;采用RT-PCR技术分析了PKS基因在利玛原甲藻中的表达状况;并通过多聚腺苷酸RNA的扩增、细菌的分离鉴定、限制性内切酶酶切、Southern blotting等技术对PKS基因进行了分析。结果表明,利玛原甲藻中PKS基因与海洋原甲藻聚为一支,在利玛原甲藻中有显著表达;以Oligo(T)引物进行RT-PCR扩增时,可出现18S rRNA和PKS基因相应条带;限制性内切酶酶切和Southern blotting结果显示,该基因中存在明显的甲基化;16S rRNA基因序列分析显示,从利玛原甲藻培养液中分离到的细菌与海洋放线菌假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)基因序列同源性达到99%,该菌株中并不存在PKS基因。结果显示,所获得的PKS基因是利玛原甲藻聚酮合酶基因,基因序列已提交GenBank(EF521601);PKS可能在腹泻性贝毒合成中起着关键作用。

聚酮合酶与药物筛选的研究进展

由于结构多样化和生物活性多样性,聚酮化合物已经成为新药的重要来源。聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)是合成聚酮类物质的酶复合体。本文介绍了聚酮合酶的分类、作用机制及相关药物筛选的研究进展。并对通过宏基因组技术,从自然环境中获得新聚酮化合物的基因筛选方法的研究进展进行了总结。

具有抗农作物病原真菌活性链霉菌Ⅰβ1菌株的筛选鉴定及其聚酮合酶基因分析

从土壤中筛选出一株具有抗农作物病原真菌活性链霉菌,命名为Ⅰβ1.根据生理生化特性对其进行了鉴定及16S rRNA基因序列同源性比对,分析了该菌株的发酵滤液抑菌稳定性和聚酮合酶基因.结果表明:该菌株初步鉴定为链霉菌属,Ⅰβ1菌株发酵滤液在温度为-20~55℃,紫外线照射10~30 min,pH为1.0~9.0条件下均较稳定,聚酮合酶基因在其系统分类上与Streptomyces noursei ATCC 11455制霉菌素生物合成基因簇的聚酮合酶基因分枝较近.

真菌聚酮合酶基因的研究进展

由真菌产生的聚酮化合物是一类庞大的次级代谢产物,具有结构和功能的多样性。聚酮合酶是介导聚酮化合物合成的关键酶。大多数真菌聚酮合酶属于重复Ⅰ型PKS,其编码基因通常与聚酮化合物合成的其它相关基因成簇存在。作者论述了真菌聚酮合酶的特性及其基因克隆方法的进展,并对其在后基因组时代的研究进行了展望。

植物Ⅲ型聚酮合酶的研究进展

综述了近10年来从植物中克隆、鉴定的型聚酮合酶(PKS)的研究进展。型PKS即查耳酮合酶超家族,能催化生成一系列结构各异、具有不同生理活性、具有查耳酮合酶(CHS)基本骨架的植物次生代谢产物,对这些PKS的基因进行调控可用于合成一些难以化学合成的新型天然化合物。目前,国内对Ⅲ型PKS在药学领域的应用研究甚少,此研究对于活性成分的生物合成具有重要意义。

链霉菌GEMSM4(6)中聚酮合酶和非核糖体多肽合成酶基因的筛选及克隆

链霉菌GEMSM 4（6）的发酵产物具有抗革兰氏阳性菌和阴性菌的活性,同时还对酵母及丝状真菌尤其是植物病原菌,具有较强的抑制作用。本研究利用简并性引物对该链霉菌基因组中可能存在的聚酮合酶（PKS）和非核糖体多肽合成酶（NRPS）基因进行PCR扩增及序列分析,找到了3个NRPS及15个PKS基因的片段,其中PKS基因与Streptomyces violaceusniger Tu 4113的PKS基因序列同源性最高,达到91%~99%;而NRPS基因与数据库中已知的NRPS基因序列同源性仅为60%~62%。为克隆NRPS生物合成基因簇,构建了链霉菌GEMSM 4（6）的基因组细菌人工染色体（BAC）文库,通过PCR筛选得到包含有这3个NRPS基因的克隆子,为后期的异源表达及基因组发掘分析提供基础。

植物Ⅲ型聚酮合酶基因家族的分子进化分析

Ⅲ型聚酮合酶(type Ⅲ polyketide synthase,PKSⅢ)广泛存在于细菌、真菌和植物中,目前数据库中已积累了大量的序列资料。为了进一步了解植物Ⅲ型聚酮合酶基因家族的分子进化,以及其作为系统进化研究材料的可能性,选取了75条来自不同植物物种包括苔藓类植物、蕨类植物、裸子植物、单子叶植物和双子叶植物的PKSⅢ蛋白序列,用CLUSTAL X软件对其氨基酸序列进行了比对,并用邻位相接法构建了系统进化树。结果表明,尽管不同来源的PKSⅢ序列表现了很大的差异,但保守结构域CHS-like所包含的主要功能位点半胱氨酸(Cys184)、苯丙氨酸残基(Phe236和Phe286)、组氨酸残基(His335)、天冬酰氨残基(Asn369)在各植物物种中具有很好的保守性;同时发现,在植物PKSⅢ序列中多数的Cys位点均具有较好的保守性,而且蕨类植物PKSⅢ和单子叶植物PKSⅢ在Cys保守位点有很好的相似性;进一步构建分子进化树表明,PKSⅢ基因基本上首先根据功能而聚类,明显地划分为CHSs和non-CHSs两类,其次按照不同的植物物种聚类。

真菌聚酮合酶基因分离方法的研究进展

真菌聚酮合酶在代谢中可催化合成多种具有重要生物学活性的次级代谢物,所以真菌聚酮合酶正逐渐成为药学、食品科学和农学等领域的研究热点。综述了近五年来建立的几种分离真菌聚酮合酶基因的方法。这些方法解决了真菌中聚酮合酶基因簇难以分离的问题,为改造和利用真菌聚酮合酶以及发掘真菌聚酮化合物资源提供了强有力的手段。

蛹虫草聚酮合酶基因的多样性分析

以蛹虫草的菌丝体为材料,利用基因组挖掘的方式从蛹虫草基因组中获得其聚酮合酶(Polyketide synthase,PKS)基因,对这些PKS基因进行生物信息学分析以推断它们的功能,并检测它们在不同培养基上的表达情况。结果表明:蛹虫草中含有13个PKS基因(CmPKS 1-13),包括2个非还原型聚酮合酶(Non-reducing PKS,NR-PKS),5个部分还原的聚酮合酶(Partial-reducing PKS,PR-PKS),6个高度还原型聚酮合酶(Highly reducing PKS,HR-PKS);聚类分析显示CmPKS 1、CmPKS 3可能参与链格孢吡喃酮(alternapyrone),CmPKS 4可能参与黄曲霉素,CmPKS 5可能参与美伐他汀,CmPKS 6可能参与分生孢子色素,CmPKS 8可能参与伊快霉素的生物合成,其余PKS与生物合成未知化合物的PKS聚为一支;半定量PCR显示CmPKS 7和CmPKS 9在4种培养基上均强烈表达;CmPKS 3、CmPKS 6在4种培养基上微弱表达;CmPKS 10、CmPKS 11和CmPKS 12只在GL培养基上强烈表达,在其余3种培养基上微弱表达;CmPKS 1和CmPKS 4只在GL培养上微弱表达,CmPKS 8仅在GS培养基上微弱表达;CmPKS 2、CmPKS 5和CmPKS 13在检测的培养基中都不表达。本研究为进一步异源表达蛹虫草中的PKS基因及其功能鉴定、具新颖结构聚酮化合物的发掘奠定基础。

利用酿酒酵母重组表达Sporotrichum laxum聚酮合酶2并发酵生产烷基间苯二酚

烷基间苯二酚(ARs)是一类在麦类等作物中存在的特殊酚类类脂,具有抗菌等重要的生物活性.本研究以酿酒酵母BJ5464-NpgA为宿主,成功重组表达了来自Sporotrichum laxum ATCC 15155的三型聚酮合酶2(Sl-PKS2).利用高效液相和质谱检测表明,该重组菌具有发酵生产5种不同ARs的能力.在发酵48 h后,上述5种ARs的产量达到最高.研究表明生物安全的宿主酿酒酵母具有发酵生产ARs的潜力.本研究对利用工业发酵生产ARs有重要的理论意义及实践价值.

真菌聚酮合酶分类进展及其应用

概述了真菌聚酮合酶几种有代表性的新分类,这些分类对于进一步认识、改造和利用真菌聚酮合酶以及开发真菌聚酮化合物资源等方面具有重要意义。

地衣型真菌皮革肾岛衣中1个Ⅲ型聚酮合酶基因的克隆与鉴定

该研究通过对皮革肾岛衣地衣型真菌转录组数据的分析,利用RT-PCR技术,首次克隆得到1个Ⅲ型聚酮合酶基因(NpPKS3),并分析该基因在不同培养基上的表达,以选择皮革肾岛衣地衣型真菌的最佳培养基,为研究NpPKS3基因功能奠定基础,并为异源表达皮革肾岛衣地衣型真菌的聚酮类化合物提供研究材料。结果表明:(1)NpPKS3基因(GenBank登录号MF351559)全长1 335bp,编码444个氨基酸,其产物为NpPKS3蛋白,在细胞质基质中发挥功能。(2)系统进化分析显示,NpPKS3基因编码的氨基酸序列与Ⅲ型聚酮合酶的csyB亚组聚为一支,推测该基因编码csyB类酶蛋白。(3)采用"一菌多产物"策略研究发现,NpPKS3基因在BMG培养基中表达能力最强,在BD培养基上表达能力最弱。

皮革肾岛衣一个聚酮合酶基因的克隆与鉴定

通过对地衣型真菌皮革肾岛衣转录组数据的分析,挖掘出1条非还原型聚酮合酶基因,通过RT-PCR首次克隆得到该基因的cDNA全长(NpPKS2),并通过生物信息学手段分析其基因和蛋白氨基酸序列,采用荧光定量PCR技术分析该基因在不同培养基上的表达情况.结果显示:NpPKS2基因全长6 249 bp,编码2 082个氨基酸;生物信息学分析显示该基因编码1种非还原型聚酮合酶,结构域顺序为SAT-KS-AT-PT-ACP-TE,根据聚类分析和结构域分析,推断NpPKS2为苔色酸合成酶;荧光定量分析显示地衣型真菌皮革肾岛衣中的NpPKS2基因用BMG培养基培养时表达量最高.