TAR克隆技术及其在微生物次级代谢产物研究中的应用

微生物次级代谢产物结构多样、种类丰富,是新药发现的重要来源。微生物次级代谢产物由特定生物合成基因簇编码合成,通常与微生物的生长繁殖无关。由于实验室可培养微生物的数量较少,而且多数可培养微生物存在基因簇沉默的现象,严重阻碍了微生物来源药物的研究和开发。微生物生物合成基因簇的异源表达及生物合成相应的次级代谢产物已逐渐成为发现新颖活性化合物的有效手段之一。作为研究微生物次级代谢产物的重要工具,基于TAR(transformation associated recombination)克隆技术的异源表达策略可实现绝大多数基因簇的完整异源表达。本文从TAR克隆技术的原理、应用和策略改进3个方面,总结了基于TAR克隆技术的微生物次级代谢产物异源生物合成的研究进展,为研究和开发新型微生物来源药物提供方法学借鉴。

同源重组方法在制备DNA大片段中的应用

目的介绍快速、简便制备DNA大片段的新方法。方法查阅国内外近年关于DNA大片段制备方法的文献33篇,对这些方法进行归纳和总结。结果综述了大肠杆菌Red/ET重组系统和基于酿酒酵母重组系统的DNA自组装和TAR克隆在DNA片段制备中的应用。结论同源重组系统不仅提高了克隆DNA大片段的效率,而且简化了操作流程。这些方法在制备DNA大片段用于组合生物合成和合成生物学制备药物中具有重要的应用前景。

基于转化相关重组克隆曲酸合成基因簇及其在黑曲霉中的异源整合表达

【背景】黑曲霉(Aspergillus niger)是一种重要的丝状真菌底盘细胞,然而对其进行大片段DNA的遗传操作存在工具缺乏、效率低下的问题。海量基因组数据中存在大量未被鉴定的次级代谢产物合成基因簇,因相应DNA分子量大而难以克隆,大部分基因与产物分子之间的映射关系尚未被解析。【目的】开发一种适配黑曲霉的大片段DNA分子直接克隆的方法。以直接克隆米曲霉(Aspergillus oryzae)来源的曲酸合成基因簇(约30 kb)在黑曲霉底盘细胞中表达,实现曲酸的异源发酵。【方法】基于转化相关重组(transformation-associated recombination,TAR)克隆,构建适配黑曲霉转化的TAR捕获骨架载体pSEA-TAR;将曲酸合成基因簇上下游各1 kb同源DNA序列先后引入pSEA-TAR,中间以唯一的XhoⅠ相隔,得到曲酸合成基因簇捕获载体pSEA-KLR;随后,将NotⅠ/SbfⅠ消化后含有完整曲酸合成基因簇及上下游同源序列的米曲霉基因组与经XhoⅠ线性化的pSEA-KLR共同转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)VL6-48,通过营养缺陷筛选获得成功捕获曲酸合成基因簇的重组子,提取质粒,电转化大肠杆菌(Escherichia coli)扩增重组质粒;借助农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导黑曲霉转化,对获得的含有曲酸合成基因簇的黑曲霉转化子进行曲酸发酵,检测曲酸合成水平。【结果】获得了含有ARSH4/CEN6、TRP1、hph和LB/RB-T-DNA repeat的基于TAR克隆、适配黑曲霉表达的大片段DNA捕获载体pSEA-TAR。借助酿酒酵母高效的同源重组系统,通过同源重组获得含有曲酸合成基因簇的重组质粒pSEA-TAR-KA,捕获成功率为5.9%。对获得的含有曲酸合成基因簇的10株黑曲霉重组菌株KA1–KA10进行发酵分析发现均成功合成了曲酸,其中黑曲霉KA-2发酵7 d后曲酸水平最高,达到5.86 g/L。【结论】构建了适配黑曲霉的TAR克隆体系,用于大片段DNA高效捕获、重构和表达大型生物合成基因簇。以来源于米曲霉的曲酸合成基因簇捕获及在黑曲霉中成功实现曲酸合成验证了其有效性,进一步丰富了黑曲霉作为底盘细胞在重要化合物绿色生物制造中的作用。

基因簇大片段克隆技术研究进展及挑战

天然产物结构复杂、活性多样,是新药开发的重要来源,对天然产物生物合成途径的研究,有利于探索酶催化的合成机制,促进复杂天然产物的应用。天然产物的生物合成由其对应的基因簇调控,其中大量天然产物生物合成基因簇(biosynthetic gene clusters,BGCs)在野生型菌株中无法表达或表达量低。对这些基因簇的研究,需要进行克隆表达,而如何克隆大片段基因簇并使其表达,从而发现新型天然产物是一个具有挑战性的问题。其中构建基因组文库、转化关联重组(transformation-associated recombination,TAR)、Red/ET重组等是克隆大片段基因簇的重要技术。本文从克隆技术的策略和应用两个方面,总结了这3种克隆技术目前的研究进展,讨论了目前大片段基因簇克隆技术面临的挑战,为研究大片段基因簇提供方法学借鉴。