TIA抗原基因原核表达载体的构建及表达

目的:克隆并构建短暂性脑缺血发作重组cDNA表达克隆血清学鉴定技术(SEREX)抗原基因原核表达载体,重组GST融合蛋白.方法:采用SEREX筛选所获的70个重组cDNA克隆pBluescript质粒,用限制性内切酶(EcoRⅠ/XhoⅠ、BamHⅠ/XhoⅠ或SmaⅠ/XhoⅠ)双酶切,用质量分数为1%琼脂糖凝胶电泳分离回收目的基因片段.应用Ligation和In-Fusion基因重组技术,将目的基因插入原核表达载体质粒pGEX-4T-1,2,3,转化表达菌株E.coli BL-21感受态细胞,并用IPTG诱导GST标签蛋白表达,通过SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物,再经酶切及DNA测序鉴定,成功重组pGEX-4T载体的插入片段可以作为候选靶抗原.结果:成功获得21个重组pGEX-4T载体的靶抗原目的基因,均能够在原核表达系统中成功表达GST融合目的蛋白.结论:应用Ligation和In-Fusion基因重组技术能够有效构建原核表达载体,并在大肠杆菌中表达重组融合目的蛋白.

TIA重组cDNA表达克隆血清抗原基因的识别

目的:应用重组cDNA表达克隆血清学鉴定技术(SEREX)筛选与识别短暂性脑缺血发作(TIA)血清相关性抗原基因.方法:采集19例TIA患者血清,免疫筛选人主动脉内皮细胞cDNA表达文库;对阳性靶抗原行单克隆扩增,经单克隆内切除后转换载体pBluescript SK(+)提取质粒;对包含cDNA插入目的基因片段的质粒进行DNA序列检测,通过NCBI-BLAST同源性检索,鉴定具有免疫原性的独立的TIA重组cDNA表达克隆血清抗原基因.结果:(1)SEREX筛选出172个重组cDNA阳性单克隆;(2)单克隆内切除后获得167个pBluescript质粒,酶切鉴定质粒中均包含有目的基因插入片段;(3)生物信息学分析:识别11个独立的重组cDNA表达克隆抗原基因.(4)基因功能解析:发现matrix metalloproteinase 1(MMP1)、chromobox homolog 1(CBX1)和chromobox homolog 5(CBX5)与TIA和脑梗死(CI)的发生、发展关系密切.结论:应用SEREX技术成功筛选及鉴定出TIA相关靶抗原基因,发现MMP1、CBX1和CBX5可能与短暂性脑缺血发作(TIA)和脑梗死(CI)发生发展有关.