平喘宁调节TRPM8通道相关蛋白干预寒性哮喘大鼠气道炎症的机制研究

目的探究冷刺激对哮喘大鼠气道炎症的影响以及平喘宁对寒性哮喘大鼠气道炎症的治疗作用及机制。方法将72只大鼠随机分成正常组,卵清蛋白(ovalbumin,OVA)组,模型组(OVA+冷刺激),平喘宁低、中、高剂量组,桂龙咳喘宁组以及地塞米松组,每组9只。除正常组外,其余各组大鼠采用OVA或OVA联合冷刺激建立哮喘及寒性哮喘大鼠模型,模型复制完成后,分别给予生理盐水及对应药液灌胃21 d。观察记录各组大鼠的一般行为学情况;采用HE染色检测大鼠肺组织病理变化;ELISA法检测支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6和胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoietin,TSLP)水平;Western blot法检测瞬时受体电位美拉塔素8(transient receptor potential melastatin subtype 8,TRPM8)、粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子(granule macrophage-colony stimulating factor,GM-CSF)、TSLP蛋白表达水平。结果与正常组比较,OVA组、模型组大鼠均出现呼吸急促、腹部收缩明显等行为学表现;病理结果显示支气管管壁增厚、肺组织及支气管周围可见大量炎症细胞浸润;BALF中IL-1β、IL-6、TSLP水平显著升高(P<0.05);肺组织TRPM8、GM-CSF、TSLP蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。与模型组比较,平喘宁可改善大鼠的行为学表现,减轻支气管管壁增厚、肺组织及支气管周围炎症细胞浸润,显著降低大鼠BALF中IL-1β、IL-6、TSLP水平(P<0.05),显著降低肺组织TRPM8、GM-CSF、TSLP蛋白表达水平(P<0.05)。结论冷刺激会加重哮喘大鼠气道炎症反应,平喘宁可能通过调控寒性哮喘大鼠TRPM8及相关蛋白表达水平,减轻寒性哮喘大鼠气道炎症反应,进而达到治疗哮喘的作用。

冰片通过TRPM8减轻小鼠心肌梗死后炎症反应并抑制心脏重构

目的:研究冰片(borneol)对小鼠心肌梗死(myocardial infarction,MI)后炎症反应和心脏重构的作用及可能机制。方法:8周龄野生型(wild-type,WT)C57BL/6小鼠和瞬时受体电位阳离子通道M亚家族成员8(transient receptor potential cation channel subfamily M member 8,TRPM8)基因敲除(TRPM8 gene knockout,TRPM8−/−)小鼠随机分为假手术组和MI组,再分别用生理盐水(对照组)或冰片(冰片组)灌胃。绘制小鼠MI后生存曲线,28 d后超声心动图检测心脏功能,多导生理记录仪测量血流动力学参数,病理染色观察MI面积、心肌肥大和间质纤维化,并检测梗死交界区心肌中炎症反应情况。结果:在WT小鼠中,梗死交界区心肌组织中TRPM8表达显著增加(P<0.05),冰片对心脏中TRPM8表达无影响(P>0.05),但可提高小鼠生存率,缩小MI面积,抑制MI后心脏重构,改善心脏功能(P<0.05或P<0.01);在TRPM8−/−小鼠中,冰片对小鼠生存率、MI面积、心肌肥大、心肌纤维化和心脏功能未见明显影响(P>0.05)。在WT小鼠中,冰片可减少中性粒细胞和巨噬细胞的浸润(P<0.01),抑制炎症因子肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6和单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)过度表达(P<0.05或P<0.01);而在TRPM8−/−小鼠中,冰片对炎症细胞数量和炎症因子表达未见明显影响(P>0.05)。结论:TRPM8可能是冰片在心脏的作用靶点;冰片可能通过TRPM8减轻MI后炎症反应和抑制心脏重构,改善小鼠MI后的心脏功能。

TRPM8通道激活剂薄荷醇对肺动脉高压大鼠的治疗作用

目的 探讨瞬时受体电位M8(transient receptor potential melastatin-8,TRPM8)通道激活剂薄荷醇(menthol)对野百合碱(monocrotaline, MCT)诱导的肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension, PAH)大鼠的治疗作用。方法 SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为6组:正常对照组、MCT组、MCT+menthol(1 mg·kg^(-1)·d^(-1))治疗组、MCT+menthol(2 mg·kg^(-1)·d^(-1))治疗组、MCT+menthol(5 mg·kg^(-1)·d^(-1))治疗组、MCT+menthol(10 mg·kg^(-1)·d^(-1))治疗组。腹腔注射MCT(50 mg·kg^(-1))构建PAH大鼠模型。造模1周后治疗组分别给予不同剂量的menthol灌胃治疗,持续2周。通过血流动力学检测、肺组织病理学染色、分子生物学技术,观察menthol对PAH大鼠右心室收缩压(RVSP)、右心室肥厚、肺小动脉(sPA)增殖重塑及钙通道蛋白(TRPM8、TRPC1、TRPC6)基因表达的影响。结果 与正常组相比,MCT组RVSP和右心质量指数(RVMI)明显升高,sPA(管腔直径50~150μm)管壁增厚,肺动脉中TRPM8表达明显降低,而TRPC1、TRPC6、心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide, ANP)和脑钠肽(brain natriuretic peptide, BNP)表达明显上调,表明PAH大鼠造模成功;不同剂量menthol治疗均可明显降低PAH大鼠的RVSP和RVMI,改善sPA增生情况,上调TRPM8的表达,同时明显降低TRPC1、TRPC6、ANP及BNP的表达。结论 Menthol通过抑制TRPC1、TRPC6、ANP和BNP的表达,明显减轻MCT诱导的PAH和右心室肥大。

N-乙酰半胱氨酸对支气管哮喘大鼠CXCL8-CXCR1/2及TRPV1神经元敏感性的影响

目的探究N-乙酰半胱氨酸对支气管哮喘大鼠CXC趋化因子配体(CXCL)8-CXC趋化因子受体(CXCR)1/2及瞬时受体电位通道蛋白(TRP)V1神经元敏感性的影响。方法选取80只SPF级SD雄性大鼠,随机分为正常(NO)组、模型(MO)组、N-乙酰半胱氨酸(NAC)组、急支糖浆(ES)组,每组20只,对MO组、NAC组、ES组进行支气管哮喘建模,建模成功后,NAC组、ES组每天分别于腹腔内注射2 ml N-乙酰半胱氨酸注射液、急支糖浆灌胃10 g/kg剂量,NO组、MO组同期灌胃同体积生理盐水,通过苏木素-伊红(HE)染色法检测肺组织病理形态、酶联免疫吸附试验(ELISA)、实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)、Western印迹检测血清及肺组织中CXCL8、CXCR1、CXCR2、TRPV1含量、mRNA及蛋白表达,并分析N-乙酰半胱氨酸对支气管哮喘大鼠CXCL8-CXCR1/2及TRPV1神经元敏感性。结果与NO组相比,MO组咳嗽次数明显增加(P<0.05),而NAC组、ES组与MO组相比,其咳嗽次数明显降低(P<0.05),且NAC组比ES组降低明显(P<0.05);与NO组相比,MO组细支气管管腔、肺泡腔内可见渗出液、脱落的上皮细胞等,远端肺泡可见局部肺不张及周围肺大泡,且肺间质明显增厚,炎性细胞浸润明显,而与MO组比较,ES组、NAC组症状明显减少,部分肺间质的组织结构趋向正常,部分肺泡轻度扩张,且NAC组比ES组明显降低(P<0.05);与NO组对比,MO组CXCL8、CXCR1、CXCR2、TRPV1含量、mRNA及蛋白表达均明显升高(P<0.05),NAC组、ES组与MO组相比均显著降低(P<0.05),且NAC组比ES组明显降低(P<0.05)。结论N-乙酰半胱氨酸可以显著降低咳嗽次数,减少支气管哮喘症状,可使CXCL8-CXCR1/2及TRPV1神经元敏感性显著降低。

瞬时受体电位通道M8调控NCR1/NKP46通路抑制胶质瘤细胞免疫逃逸的作用研究

目的:探讨瞬时受体电位通道M8(TRPM8)对胶质瘤细胞免疫逃逸的影响,并初步探究可能的作用机制。方法:通过实时荧光定量PCR法检测人正常胶质细胞株(SVGp12)与3种胶质瘤细胞株(U251、U373、T98G)中TRPM8基因表达;将U251细胞随机分为空白对照组、TRPM8-siRNA组、NC-siRNA组、pcDNA3.1-TRPM8组和pcDNA3.1-NC组,利用脂质体分别将TRPM8-siRNA、NC-siRNA、pcDNA3.1-TRPM8和pcDNA3.1-NC转染至U251细胞中,采用实时荧光定量PCR法和Western blot检测细胞中TRPM8基因和蛋白表达,CCK-8法、集落形成实验和流式细胞术检测细胞增殖、克隆形成及凋亡情况,乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测NK92细胞对U251细胞的杀伤作用,ELISA法检测TNF-α、IL-2、IL-6、IFN-γ水平,流式细胞术、Western blot检测细胞调节区域因子1(NCR1)与自然杀伤因子蛋白46(NKP46)的表达。结果:3种胶质瘤细胞株U251、U373、T98G中TRPM8 mRNA表达水平均显著高于正常胶质细胞株SVGp12,其中U251细胞最高;与空白对照组相比,TRPM8-siRNA组TRPM8 mRNA和蛋白的相对表达量均下调(P<0.01),细胞活性下降(P<0.05),细胞克隆形成数目减少(P<0.01),细胞凋亡率升高(P<0.01),NK92细胞对U251细胞的杀伤率提高(P<0.01),细胞上清液中TNF-α、IL-2、IL-6及IFN-γ水平均下降(P<0.01),同时,NCR1、NKP46表达也明显增加(P<0.01);与空白对照组相比,pcDNA3.1-TRPM8组TRPM8 mRNA和蛋白的相对表达量均上调(P<0.01),细胞活性升高(P<0.05),细胞克隆形成数目增加而凋亡率下降(P<0.01),NK92细胞对U251细胞的杀伤率下降(P<0.01),细胞上清液中TNF-α、IL-2、IL-6及IFN-γ水平均升高(P<0.01),NCR1、NKP46表达减少(P<0.01)。结论:抑制TRPM8表达能够调控胶质瘤微环境中免疫抑制状态,增强NK92细胞杀伤U251细胞的能力,削弱肿瘤细胞的免疫逃逸能力,这可能与调控NCR1/NKP46通路相关。

过表达TRPM8在SCN5A错义突变后对肥大细胞功能的影响

目的探究过表达瞬时受体电位阳离子通道M8(TRPM8)在心脏钠通道基因(SCN5A)错义突变后对肥大细胞功能的影响。方法构建TRPM8基因过表达载体及SCN5A干扰载体并分别转染入人肥大细胞HMC-1中,转染成功后用CCK8检测细胞增殖能力,qPCR、Western blot法检测TRPM8与SCN5A的表达情况,中性红染色计算肥大细胞脱颗粒百分率,比色法测定β-氨基己糖苷酶释放率。结果TRPM8基因过表达及SCN5A干扰载体成功构建;与空白对照组相比,过表达TRPM8与干扰SCN5A后均抑制了HMC-1细胞的增殖能力,过表达TRPM8对HMC-1细胞增殖能力的抑制作用低于干扰SCN5A组(P<0.05);与干扰SCN5A组相比,干扰SCN5A的同时过表达TRPM8后对HMC-1细胞增殖能力的抑制作用有所降低(P<0.05);与空白对照组相比,过表达TRPM8降低HMC-1细胞脱颗粒反应和β-氨基己糖苷酶释放率,干扰SCN5A后增强了HMC-1细胞脱颗粒反应和β-氨基己糖苷酶释放率(P<0.05);与干扰SCN5A后相比,在干扰SCN5A的同时过表达TRPM8可降低HMC-1细胞脱颗粒反应和β-氨基己糖苷酶释放率(P<0.05);干扰SCN5A后可下调HMC-1细胞中TRPM8的表达(P<0.05)。结论TRPM8可以抑制SCN5A错义突变后对肥大细胞的激活作用,并可能通过调控SCN5A来减缓肠易激综合征患者疼痛等不适症状。

瞬时受体电位通道家族M8型受体转基因小鼠模型的建立

目的建立瞬时受体电位通道家族M8型受体(TRPM8)转基因小鼠模型。方法通过显微注射法将pcDNA3.1-h Trpm8导入C57BL/6J×CBA F1小鼠的受精卵中,并将其移植到假孕母鼠输卵管中获得子代小鼠。采用PCR方法鉴定子代基因型,通过RT-PCR和免疫印迹法检测Trpm8基因及蛋白在组织中的表达。结果将405枚注射受精卵移植给15只假孕鼠,其中13只顺利妊娠并产下95只子鼠,经PCR鉴定得到5只转基因阳性首建鼠,其中4只小鼠可稳定传代,经与C57BL/6J小鼠回交7代后互交数代建系。子代转基因小鼠经RT-PCR检测发现Trpm8基因在心脏、肝脏、肾脏、脂肪和骨骼肌中均有表达,且TRPM8蛋白表达在转基因小鼠中显著增加。结论通过显微注射法成功建立了Trpm8转基因小鼠模型。

TRPM8在舌癌组织及Tca8113中的表达及其意义

目的观察瞬时受体电位M8(transient receptor potential melastatin type8,TRPM8)在舌癌组织及舌癌细胞系Tca8113中的表达,探讨其在肿瘤生成与发展中的意义。方法应用免疫组织/细胞化学方法检测TRPM8在舌癌组织、Tca8113细胞株、舌乳头状瘤组织和正常舌体组织中的表达;应用Western blot检测TRPM8在舌癌组织、、Tca8113细胞及正常舌体组织中的表达。结果免疫组织化学显示:TRPM8在舌癌组织中100%(22/22)呈强阳性表达;而在舌乳头状瘤组织中18%(2/11)呈强阳性表达,45%(5/11)呈弱阳性表达,余为阴性表达;正常舌体组织中10%(1/10)呈弱阳性表达,余为阴性表达。TRPM8在舌癌、舌乳头状瘤及正常舌体组织中的表达有统计学差异(P<0.05)。免疫细胞化学显示:TRPM8在舌癌细胞Tca8113中呈阳性表达。Western blot结果显示舌癌细胞及组织中TRPM8表达水平明显高于正常舌体组织。结论 TRPM8在舌癌中的高表达提示肿瘤的发生发展可能受到离子通道蛋白的调节。

肺腺癌表达TRPM8蛋白的意义

目的:探讨肺腺癌表达瞬时受体电位阳离子通道M亚家族成员8(TRPM8)蛋白的意义。方法:收集112例肺腺癌患者的肿瘤组织标本,对其进行4~5年临床随访。免疫组织化学染色检测肿瘤组织中TRPM8蛋白的表达,分析TRPM8蛋白表达与肺腺癌患者临床特征及预后的关系。培养A549肺腺癌细胞,通过感染慢病毒上调细胞中TRPM8蛋白的表达,CCK-8法及集落形成实验检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期及凋亡,划痕实验及Transwell实验观察细胞迁移和侵袭。培养H1299肺腺癌细胞,通过感染慢病毒上调细胞中TRPM8表达后,分别在免疫缺陷小鼠左右臀部皮下注射对应空载体细胞及上调TRPM8的细胞,分析TRPM8对移植瘤生长的影响。结果:肺腺癌组织存在TRPM8表达。TRPM8蛋白高表达的肺腺癌患者,其4~5年累积生存率高于TRPM8蛋白低表达的患者(P=0.017),且其肿瘤最大径小于低表达的患者(P=0.028)。上调A549细胞中TRPM8的表达后,细胞活力较空载体组和亲本细胞组显著减弱,形成的集落数显著减少,处于S期的细胞比例显著升高,迁移和侵袭能力显著下降(P<0.01)。与空载体对照细胞株比较,上调H1299细胞中TRPM8的表达后,其在免疫缺陷小鼠皮下的移植瘤生长速率显著下降,肿瘤重量显著降低(P<0.01)。结论:TPRM8在肺腺癌中具有抑癌作用,低表达TRPM8蛋白的肺腺癌患者预后不良。

薄荷醇对低压低氧诱导小鼠肺动脉高压的作用及机制研究

目的 探讨薄荷醇对低压低氧诱导小鼠肺动脉高压的作用和机制。方法 健康雄性10~12周C57小鼠、瞬时受体电位通道M8基因敲除(TRPM8-/-)小鼠各40只,分为对照组、薄荷醇组、低压低氧组、低压低氧+薄荷醇组,超声测量肺动脉加速时间(PAT)和肺动脉射血时间(PET),右心导管测量右心室收缩压(RVSP),计算右心室肥厚指数(RVHI),观察肺小动脉重构(<100μm)情况,Western blot检测Krüppel样因子4(KLF-4)和增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达。肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)经低氧(3%氧浓度)、低氧+薄荷醇(100μmol·L^(-1))处理,测定增殖和迁移能力。结果 薄荷醇处理野生型小鼠后,PAT和PAT/PET比值增加(P<0.05),RVSP和RVHI降低(P<0.05),同时肺小动脉增厚和管腔狭窄程度减轻(P<0.05),KLF4表达增加(P<0.05)、PCNA表达降低(P<0.05);薄荷醇处理TRPM8-/-小鼠后,PAT、PAT/PET、RVSP、RVHI、KLF4、PCNA表达和肺血管重构均未见明显改变(P>0.05)。薄荷醇干预PASMCs后增殖、迁移能力下降(P<0.01、P<0.05)。结论薄荷醇可能通过TRPM8抑制PASMCs增殖、迁移,改善低压低氧诱导的小鼠肺血管重构和肺动脉高压,其机制可能与上调KLF4表达有关。

薄荷醇通过激活瞬时受体电位M8(TRPM8)促进BEAS-2B人支气管上皮细胞的细胞因子分泌

目的探讨瞬时受体电位M8(TRPM8)在薄荷醇诱导BEAS-2B人支气管上皮细胞表达气道上皮源性细胞因子白细胞介素25(IL-25)、IL-33和胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)中的作用及其相关信号转导机制。方法用2 mmol/L薄荷醇处理BEAS-2B细胞1、2、3、4 h,选择IL-25、IL-33、TSLP或Ca^(2+)表达较高的时间组,通过小干涉RNA(siRNA)特异性敲低TRPM8(si-TRPM8),采用细胞内钙离子螯合剂1,2-二(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N′,N′-四乙酸四乙酰氧甲基酯(BAPTA-AM)及核因子κB(NF-κB)抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)处理。CCK-8法检测细胞活力;实时荧光定量PCR检测IL-25、IL-33和TSLP mRNA表达;ELISA检测培养上清液IL-25、IL-33和TSLP蛋白水平;Fluo-4 AM负载结合流式细胞术检测胞内Ca^(2+)荧光强度;Western blot法检测si-TRPM8对BEAS-2B细胞合成TRPM8蛋白的干扰效率及NF-κB p65蛋白表达的影响。结果与空白对照组比,薄荷醇组IL-25、IL-33、TSLP mRNA及蛋白、胞内Ca^(2+)水平和NF-κB p65蛋白表达均增加;敲低TRPM8后,抑制薄荷醇诱导的Ca^(2+)、IL-25、IL-33、TSLP和NF-κB p65表达增加,BAPTA-AM和PDTC均可抑制薄荷醇诱导的IL-25、IL-33和TSLP的高表达。结论薄荷醇通过激活TRPM8引起Ca^(2+)浓度升高、激活NF-κB通路诱导BEAS-2B支气管上皮细胞IL-25、IL-33和TSLP的分泌。

瞬时受体电位M8离子通道功能及其翻译后修饰调节机制

瞬时受体电位M8(transient receptor potential melastatin 8,TRPM8)又称冷及薄荷醇感受器,位于细胞膜或细胞器膜上,是瞬时受体电位(transient receptor potential,TRP)通道超家族中的一员。TRPM8通道分布广泛,是一个非选择性阳离子通道,可作为冷热传感器和冷痛传感器进行信号传导,参与众多生物过程的调节,在维持细胞内外稳态、控制离子进出细胞方面具有重要作用。研究发现,蛋白质翻译后修饰(post-translational modification,PTM)通过调控TRPM8通道的功能,进而影响多种疾病的发生和发展。因此,探究TRPM8的翻译后修饰的过程,对深入了解TRPM8的功能及调控机制是十分必要的。目前,已报道的TRPM8翻译后修饰包括磷酸化、泛素化和糖基化等,它们能够调控蛋白质的相互作用和改变TRPM8离子通道的活性,从而调控细胞增殖、迁移和凋亡。值得注意的是,TRPM8的表达与前列腺癌、膀胱癌和乳腺癌等多种癌症密切相关。本文将从TRPM8离子通道的结构出发,系统地阐述TRPM8蛋白翻译后修饰和激动剂、拮抗剂以及一些蛋白质对TRPM8通道活性的调节,同时总结TRPM8在前列腺癌、膀胱癌和乳腺癌中的新进展,为癌症治疗提供新方向和新思路。

TRPM8对间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征小鼠疼痛症状及神经元增殖的影响

目的探讨瞬时受体电位M8(TRPM8)对间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征(IC/BPS)小鼠疼痛症状及神经元增殖的影响。方法将雌性野生型C57BL/6小鼠(8~10周龄)按随机数字表法分为对照组、IC/BPS模型组和IC/BPS模型+薄荷醇组(各6只);TRPM8基因敲除小鼠随机分为TRPM8基因敲除组和TRPM8基因敲除模型组(各6只)。IC/BPS模型组、IC/BPS模型+薄荷醇组和TRPM8基因敲除模型组小鼠皮下注射尿路斑块蛋白65-84氨基酸残基(UPK3A65-84)多肽;IC/BPS模型+薄荷醇组继续注射薄荷醇。建模成功后,通过机械敏感性评估各组疼痛阈值的差异;膀胱壁注射细胞膜红色荧光探针(Dil),10 d后采集背根神经节(DRG)组织,利用Western蛋白印迹法和实时定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)分别检测各组TRPM8和生长相关蛋白43(GAP43)的蛋白质和mRNA含量的差异;免疫荧光技术检测DRG组织中TRPM8表达与GAP43或Dil的分布情况。分析TRPM8与IC/BPS小鼠疼痛症状的关系及在神经元增殖中的作用。结果模型均构建成功。与对照组相比,IC/BPS模型组和IC/BPS模型+薄荷醇组小鼠的疼痛阈值均降低[分别为(8.50±1.22)、(5.50±1.05)比(11.67±2.16),均P<0.001]。与对照组相比,IC/BPS模型组和IC/BPS模型+薄荷醇组TRPM8的表达量均升高,而在TRPM8基因敲除组小鼠中TRPM8未表达[分别为(3.16±0.05)、(6.46±0.21)、0比(1.00±0.06),均P<0.001]。各组小鼠TRPM8蛋白表达量与mRNA表达趋势相同(P<0.001)。与对照组相比,IC/BPS模型组和IC/BPS模型+薄荷醇组DRG中GAP43 mRNA的表达增加,而TRPM8基因敲除模型组的表达下降(均P<0.001)。GAP43蛋白表达与mRNA表达趋势相同(P<0.001)。免疫荧光结果显示,与对照组相比,IC/BPS模型组和IC/BPS模型+薄荷醇组DRG中GAP43阳性神经元的数量增加,TRPM8基因敲除组下降(均P<0.001)。与对照组相比,IC/BPS组和IC/BPS模型+薄荷醇组DRG Dil阳性感觉神经元数量增加,而TRPM8基因敲除组下降(均P<0.001)。结论TRPM8可加剧IC/BPS小鼠的疼痛症状,其机制可能与诱导DRG水平的感觉神经增殖有关。

人气道上皮细胞感知冷刺激的受体机制

目的探讨温度感受器瞬时受体电位蛋白-8(transient receptor potential melastatin 8,TRPM8)在人气道上皮细胞感受冷刺激过程中发挥的作用及其机制。方法用薄荷醇及冷空气(18℃)刺激人气道上皮16HBE细胞:1以TRPM8通道特异性拮抗剂BCTC、TRPM8 shRNA为干预手段,动态观察在薄荷醇、冷刺激作用下细胞内Ca2+荧光强度变化来监测气道上皮细胞上TRPM8的功能;2以磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate,PIP2)荧光分子探针PLCδ1-PH-GFP转染细胞,通过动态观察各组细胞内PLCδ1-PH-GFP从细胞膜至细胞质的荧光转位变化来检测PIP2的动态变化来研究冷刺激作用下TRPM8的信号通路。结果 1细胞内相对钙离子浓度变化:薄荷醇组处理4 min后、冷刺激组处理6 min后分别为(5.80±0.34)、(5.02±0.36),明显高于对照组(1.04±0.12)、(1.03±0.08)(P<0.05),1 mmol/L薄荷醇组+BCTC组、1 mmol/L薄荷醇组+转染TRPM8 shRNA组最高值分别为(2.68±0.19)、(1.08±0.16),明显低于1 mmol/L薄荷醇组,18℃+BCTC组、18℃+转染TRPM8 shRNA组最高值分别为(1.77±0.22)、(1.02±0.18),明显低于18℃组(均P<0.05);2PLCδ1-PH-GFP从细胞膜至细胞质的转位变化(Fm/Fc值):1 mmol/L薄荷醇组、冷刺激组最高值分别为(0.90±0.01)、(0.90±0.01),明显高于对照组最高值(1.01±0.02)(P<0.05),细胞处理200 s时1 mmol/L薄荷醇+BCTC15μmol/L组、1 mmol/L薄荷醇组+转染TRPM8 shRNA组分别为(0.86±0.03)、(0.89±0.02),明显低于1 mmol/L薄荷醇组(0.36±0.06)(P<0.05),细胞处理220 s时18℃+BCTC15μmol/L组、18℃+转染TRPM8 shRNA组分别为(0.82±0.02)、(0.93±0.01),明显低于18℃组(0.40±0.06)(P<0.05)。结论TRPM8受体是人气道上皮细胞感受冷刺激的主要受体,并通过TRPM8→Ca2+→PLC→PIP2信号通路引起气道黏液高分泌等反应。

平喘宁通过TRPM8/PKC/NF-κB信号通路缓解冷刺激加重的人支气管上皮细胞炎症作用机制研究

目的探讨平喘宁(PCN)通过瞬时受体电位melastatin家族成员8/蛋白激酶C/核因子-κB(TRPM8/PKC/NF-κB)信号通路对缓解冷刺激加重的人支气管上皮细胞炎症的作用机制,以此阐发平喘宁治疗寒哮的科学内涵。方法选用人支气管上皮细胞16HBE作为研究对象,用流式细胞术检测18℃培养不同时间的16HBE细胞的Ca^(2+)表达水平,选择Ca^(2+)水平较高的时间段组作为模型组;采用细胞增殖与活性检测试剂盒(CCK-8)法检测TRPM8离子通道的特异性抑制剂(BCTC)和PCN冻干粉对16HBE细胞的活性影响,以筛选出作用于16HBE细…胞的适宜条件的浓度和时间。将细胞分为对照组、18℃冷刺激组(模型组)、18℃+BCTC组(BCTC组)、18℃+PCN冻干粉组(PCN组)、18℃+BCTC+PCN冻干粉组(BCTC+PCN组)。流式细胞术测量各组细胞内Ca^(2+)浓度变化;qRT-PCR测定各组TRPM8、PKC、NF-κB mRNA的表达水平;免疫荧光标记法检测各组磷酸化PKC、磷酸化NF-κB抑制因子(IκB)的蛋白含量;ELISA法检测各组细胞炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-13(IL-13)的含量变化。结果与对照组比较,模型组的Ca^(2+)浓度显著升高(P<0.01),TRPM8、PKC、NF-κB p65 mRNA表达水平显著升高(P<0.01),磷酸化IκB、磷酸化PKC表达水平显著升高(P<0.01),促炎因子TNF-α、IL-13表达水平显著升高(P<0.01)。与模型组比较,PCN组的Ca^(2+)浓度显著降低(P<0.01),TRPM8、PKC、NF-κB p65 mRNA表达水平显著降低(P<0.01),磷酸化IκB、磷酸化PKC表达水平显著降低(P<0.01),促炎因子TNF-α、IL-13表达水平显著降低(P<0.01)。与BCTC组相比,PCN组的Ca^(2+)浓度均显著降低(P<0.01),NF-κB p65 mRNA表达水平显著降低(P<0.05),TRPM8、PKC mRNA表达水平降低,但差异无统计学意义(P>0.05),磷酸化IκB、磷酸化PKC表达水平显著降低(P<0.01),促炎因子TNF-α、IL-13表达水平显著降低(P<0.01);BCTC+PCN组的Ca^(2+)浓度均显著降低(P<0.01),TRPM8、PKC、NF-κB p65 mRNA表达水平显著降低(P<0.01),磷酸化IκB、磷酸化PKC表达水平显著降低(P<0.01),促炎因子TNF-α、IL-13表达水平显著降低(P<0.01)。结论平喘宁可能通过调节TRPM8/PKC/NF-κB信号通路减轻冷刺激加重的人支气管上皮细胞炎症。

薄荷醇通过mTOR活化促进人支气管上皮细胞气道炎症相关因子的表达

目的探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)活化对薄荷醇诱导的人支气管上皮细胞(BEAS-2B)气道炎症相关因子表达的影响及其机制。方法将细胞分为4组:正常对照组、薄荷醇组、雷帕霉素组、薄荷醇+雷帕霉素组。用CCK-8法检测细胞存活率,实时荧光定量PCR检测瞬时受体电位蛋白-8(TRPM8)、肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-1βmRNA的表达,Western blot检测BEAS-2B中磷酸化的mTOR(p-mTOR)、TRPM8、TNF-α和IL-1β的蛋白表达。用流式细胞术检测胞内Ca2+荧光强度。结果与正常对照组相比,薄荷醇组中细胞TNF-α和IL-1βmRNA及蛋白表达升高,p-mTOR蛋白表达升高,胞内Ca2+浓度升高(P<0.05)。与正常对照组相比,雷帕霉素组中细胞TNF-α和IL-1βmRNA及蛋白表达均无差异(P>0.05),p-mTOR蛋白表达降低(P<0.05),胞内Ca2+浓度无差异(P>0.05)。与薄荷醇组相比,薄荷醇+雷帕霉素组中细胞TNF-α和IL-1βmRNA及蛋白表达降低,p-mTOR蛋白表达降低,胞内Ca2+浓度降低(P<0.05)。结论薄荷醇可能通过活化mTOR诱导胞内Ca2+浓度升高,进而促进气道炎症相关因子IL-1β和TNF-α的表达。

TRP channels in prostate cancer： the good, the bad and the ugly？

During the last decade, transient receptor potential （TRP） channels emerge as key proteins in central mechanisms of the carcinogenesis such as cell proliferation, apoptosis and migration. Initial studies showed that expression profile of some TRP channels, notably TRP melastatin 8 （TRPM8）, TRP vanilloid 6 （TRPV6）,TRP canonical （TRPC6） and TRPV2, is changing during the development and the progression of prostate cancer towards the hormone-refractory stages. The link between the change in expression levels and the functional role of these channels in prostate cancer is step by step being elucidated. These recent advances are here described and discussed.

肉桂醛对0℃冷应激大鼠背根神经节神经细胞胞浆内Ca^(2+)变化及TRPA1和TRPM8 mRNA表达的影响

目的:观察肉桂醛对0℃冷应激大鼠背根神经节神经细胞胞浆内Ca^(2+)浓度变化,并探讨其对瞬时受体电位通道蛋白A1(TRPA1)和M8(TRPM8)mRNA表达的影响。方法:取大鼠原代背根节神经细胞置于0℃冷应激状态,噻唑蓝(MTT)法检测不同时长冷应激状态下细胞的活性;加入肉桂醛,采用激光共聚焦显微镜观察细胞内外Ca^(2+)分布的变化;另以实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测其TRPA1,TRPM8 mRNA的表达。结果:不同时长的冷应激状态下,细胞存活度无明显差异;冷应激可降低背根神经节(DRG)神经细胞胞浆内Ca^(2+)浓度(P<0.05),一定量的肉桂醛则能使Ca^(2+)浓度显著升高(P<0.01)。Real-time PCR检测显示,长时间冷应激TRPA1 mRNA表达上调(P<0.05);长时间冷应激TRPM8 mRNA表达明显要高于短时冷应激(P<0.05);适当浓度的肉桂醛使冷应激大鼠DRG神经细胞TRPA1 mRNA表达升高(P<0.05,P<0.01),对TRPM8 mRNA的影响尚不明显。结论:冷应激能影响TRPA1,TRPM8 mRNA的表达,降低胞浆内Ca^(2+)浓度,作用机制可能为肉桂醛通过活化TRPA1通道,升高细胞浆内Ca^(2+)浓度。

瞬时受体通道TRPM8及其对前列腺癌的影响

瞬时受体电位melastatin8(transient receptor potential melastatin8,TRPM8)蛋白是瞬时受体电位(transientreceptor potential,TRP)蛋白超家族中的一员,负责调控细胞内游离钙离子的动态平衡,在细胞增殖、凋亡以及分化中起着重要的作用。TRPM8最初作为一种前列腺特异性蛋白被克隆出来,之后发现其在肺癌、乳腺癌、结肠癌以及皮肤来源的恶性肿瘤中均有表达。最新研究发现,TRPM8不仅能感知冷知觉,还可作为前列腺癌诊断和治疗的新靶点。本文对TRPM8的结构、功能、定位、调控及其在前列腺癌发生和发展中的作用研究进行回顾,并对其在前列腺癌诊断和治疗中的应用前景进行展望。

瞬时受体电位M8离子通道对冷刺激诱导气道上皮细胞炎症反应的影响

目的探讨瞬时受体电位M8离子通道（TRPM8）在冷刺激诱导气道上皮细胞产生炎性因子过程中发挥的作用及相关信号转导机制。方法用冷空气（18℃）刺激人气道上皮16HBE细胞，以TRPM8通道特异性拮抗剂BCTC、TRPM8shRNA及蛋白激酶C（PKC）特异性抑制剂钙磷酸蛋白C为干预手段，将细胞分为对照组（37℃培养）、冷刺激组、冷刺激＋BCTC组、冷刺激＋转染TRPM8 shRNA组、冷刺激＋转染对照shRNA组、冷刺激＋钙磷酸蛋白C组。Western blot法检测TRPM8 shRNA转染对16HBE细胞合成TRPM8蛋白的干扰效率；钙离子成像技术测量前5组细胞内每10s间隔的相对Ca^2＋浓度动态变化；ELISA法检测各组细胞分泌的白细胞介素（IL）-6、IL-8、肿瘤坏死因子（TNF）-α蛋白含量；实时荧光定量PCR检测各组细胞中IL-6、IL．8、TNF-α mRNA表达水平。结果冷刺激组细胞内相对Ca^2＋浓度最高值为2．36±0．24，显著高于对照组的1．01±0．02（t=12．52，P〈0．01），冷刺激＋BCTC组、冷刺激＋转染TRPM8 shRNA组细胞内相对Ca^2＋浓度降为1．47±0．17和1．26±0．12，显著低于冷刺激组（t值分别为6．69、9．12，均P〈0．01）；冷刺激组的IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA和蛋白含量分别为0．66±0．16、0．77±0．15、0．73±0．09、（92±13）ng／L、（125±22）ng／L、（88±12）ng／L，较对照组[0．37±0．08、0．32±0．07、0．48±0．10、（52±8）ng／L、（50±9）ng／L、（61±8）ng/L]显著升高（t值分别为3．20、5．36、3．36、5．24、6．26、3．74，均P〈0．05），冷刺激＋BCTC组[分别为0．42±0．09、0．52±0．13、0．52±0．12、（72±8）ng／L、（92±14）ng／L、（68±11）ng／L]、冷刺激＋转染TRPM8 shRNA组[分别为0．41±0．10、0．49±0．08、0．50±0．08、（60±12）ng／L、（89±14）ng／L、（68±11）ng/L]、冷刺激＋钙磷酸蛋白C组[分别为0．40±0．07、0．44±0．09、0．47±0．08、（69±9）ng／L、（86±15）ng／L、（61±10）ng／L]较冷刺激组显著降低（均P〈0．05）；冷刺激＋转染对照shRNA组[分别为0．61±0．10、0．69±0．11、0．64±0．13、（89±13）ng/L、（118±20）ng／L、（79±13）ng／L]与冷刺激组比较差异无统计学意义（t值分别为0．48、0．79、1．12、0．35、0．43、1．00，均P〉0．05）。结论冷空气可通过激活气道上皮细胞上的TRPM8离子通道而诱导Ca^2＋内流进而激活下游PKC信号通路，进而导致代表性炎性因子的表达及生成增多。