降低mRNA翻译起始区的稳定性原核非融合表达HAb18GEF

为在大肠杆菌中非融合表达肝癌相关抗原HAb18G胞外区片段 (HAb18GEF) ,将HAb18GEF基因的cDNA插入原核表达载体pET2 1a +。通过计算机辅助设计 ,对重组的HAb18GEF pET2 1a +的mRNA翻译起始区 (TIR)的二级结构和密码子偏性同时进行预测。结果发现其存在稳定的茎环结构和许多稀有密码子。通过优化二级结构和优化密码子偏性二种策略分别来降低HAb18GEF pET2 1a +的mRNA翻译起始区 (TIR)的稳定性。在不改变氨基酸序列的前提下 ,利用密码子的简并性 ,通过非连续定点突变实现这两种优化。将突变前后的重组子经酶切鉴定和测序验证后 ,转化感受态JM10 9 DE3宿主菌后 ,随机挑菌 3 7℃下用IPTG诱导表达。SDS PAGE、间接ELISA、Westernblot和细胞分级分离法分析这些重组子的诱导表达情况。RNAdotblot对比分析优化前后目的基因mRNA的量。结果证明 ,成功地构建了HAb18GEF pET2 1a +及其二种优化突变体。仅优化TIR区二级结构或仅优化TIR区密码子偏性均能实现HAb18GEF蛋白的非融合表达 ,而未优化的重组子不表达任何HAb18GEF。非融合表达产物在大肠杆菌中主要以包涵体形式存在 ,高达 2 9 3 %。由于过表达和细胞渗漏 ,培养基和周质腔中也可检测到少许的HAb18GEF。优化二级结构和优化密码子偏性二种策略的HAb18GEF的非融合?

牛GDF9和BMP15基因遗传变异与双胎性状的关系研究

以生长分化因子9（Growth differentiation factor 9,GDF9）基因和骨形态发生蛋白15（Bone morphogenetic protein 15,BMP15）基因作为牛双胎性状的候选基因,研究了它们在鲁西牛、秦川牛、南阳牛和中国荷斯坦牛4个品种中的遗传变异,并在鲁西牛群体中研究了其多态位点与双胎性状的关系.结果表明：在鲁西牛中GDF9基因的3＇UTR发现缺失突变,而其它3个品种中没有发现该突变.对鲁西牛群体中该多态位点与单、双胎性状之间进行卡方显著性检验表明,单胎牛群体与双胎牛群体基因型分布有极显著的差异（P=0.006）,双胎牛群体的B等位基因频率明显大于单胎牛群体.通过生物信息学分析表明,突变体mRNA的二级结构与野生型相比总自由能值差异不大,但突变体mRNA翻译起始位点的二级结构稳定性明显大于野生型.在鲁西牛、南阳牛和秦川牛的BMP15基因中发现编码区第759～762 位有GAAA 4个碱基存在缺失突变,但没有检测到突变纯合个体,中国荷斯坦牛中没有检测到该突变.卡方显著性检验表明单胎牛群体和双胎牛群体在该位点基因型组成差异不显著（P=0.947）.

m RNA5′端不同位置的二级结构对原核生物翻译起始的影响

一个 2 1 bp的序列插入 B50中的人 PCNA- Lac Z′融合蛋白 m RNA的 SD序列的上游 1 1 bpH ind 切点处 ,构成正、反向插入的两个重组质粒 B50 il、B50 i2 .通过计算机程序对 m RNA二级结构的模拟分析 ,B50 il的插入序列在翻译起始区 (TIR)前形成一个发夹结构 ,但不影响 TIR的二级结构 ;B50 i2的插入序列在 TIR 5′端形成一个二级结构 ;而另一克隆 D1 3与 B50因 SD前后的 6个和 7个碱基序列的不同 ;使翻译起始区 TIR的 SD到 AUG附近的二级结构不相同 .实验测定的四者的β-半乳糖苷酶活性与计算机计算的解开 m RNA TIR的二级结构所需能量ΔE进行比较 ,其结果说明 m RNA TIR前面的二级结构对翻译起始无影响 ,而位于 TIR的 5′端的二级结构对翻译起始效率是有影响的 .不过 ,它与 m RNA TIR的 SD到 AUG的附近的二级结构对翻译起始效率的影响相比 ,TIR5′端二级结构的影响比较小 .同时 ,PCNA- Lac Z和 PCNA- Lac Z′两种融合蛋白的β-半乳糖苷酶活性也进行了比较 ,酶活性有差别 ,但不同质粒酶活性的比值仍相同 .

优化mRNA翻译起始区提高人粒－巨噬细胞集落刺激因子在E．coli中的表达

人粒－巨噬细胞集落刺激因子（ｈＧＭ－ＣＳＦ）是一种重要的造血生长因子．利用基因重组技术构建两个ｈＧＭ－ＣＳＦ的Ｅ．ｃｏｌｉ表达菌株，一个为在不改变氨基酸顺序的前提下，对ｍＲＮＡ翻译起始区核苷酸顺序进行优化突变（ｈＧＭ－ＣＳＦ（Ｍ）），另一个为未突变的对照（ｈＧＭ－ＣＳＦ（Ｎ））．经酶切电泳、ＤＮＡ测序、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ等分析鉴定，证明两者均能表达特异性的１４．６ｋＤｈＧＭ－ＣＳＦ，但ｈＧＭ－ＣＳＦ（Ｍ）的表达水平较ｈＧＭ－ＣＳＦ（Ｎ）提高了１．２６倍，占菌体总蛋白的１６．９％．ｍＲＮＡ翻译起始区二级结构预测分析表明，优化突变后生成自由能ΔＧ从原来的－１０．２提高至－９．４Ｋｃａｌ，ＡＵＧ从部分配对状态变为非配对状态．

翻译起始区二级结构对荧光素酶基因在COS-7细胞中表达效率的影响

在荧光素酶基因起始密码子ATG下游插入4种串连重复的密码子(6×ATT ,3×ATT ,6×GCC与3×GCC) ,得到具有不同二级结构的翻译起始区(translationinitiationregion ,TIR) ,以研究TIR二级结构对该基因在COS 7细胞中表达的影响.Northern印迹结果显示,4种重组子mRNA的转录水平没有显著差异,而Western印迹与酶活性检测表明,与野生型结构相比,6×ATT与3×ATT能显著提高荧光素酶的表达量与活性,而6×GCC结构的表达量明显下降.使用计算机辅助分析软件,扫描上述TIR结构发现,TIR稳定性或二级结构复杂度是导致上述表达差异的主要原因.

mRNA翻译起始区二级结构改变对干扰素基因在大肠杆菌中翻译的影响

为研究mRNA翻译起始区结构与基因表达的关系,利用密码子的简并性,在不改变表达产物氨基酸序列的前提下定点突变α8干扰素及αA干扰素衍生物基因的5′端若干位点,使其与表达载体重组后转录形成的mRNA翻译起始区结构发生改变。SDS-PAGE及活性测定证实这些改变提高了外源基因的表达水平。RNA斑点印迹表明突变前后基因转录水平差别不大,表达水平的提高主要由于翻译效率的提高。mRNA翻译起始区二级结构预测提示其生成自由能(ΔG)的变化可能与表达水平的提高有关。

颗粒裂解肽抗菌结构域在大肠杆菌中表达水平的分析

为实现颗粒裂解肽抗菌结构域的高效表达并避免其对宿主菌的毒性,研究设计了共表达阴离子配体重组生产阳离子抗菌肽的方法。结果证明该方法可有效提高阳离子抗菌肽的表达产量。同时研究分析了颗粒裂解肽不同抗菌结构域在同一原核表达载体pACYCDuet-1中表达水平的实验数据。通过计算机程序对mRNA二级结构的模拟分析,计算并比较出其二级结构生成自由能之间的差异,提出了预测颗粒裂解肽抗菌结构域在E.coli中表达水平的几点依据,参考这些依据可以对不同抗菌肽基因进行改造以获得高效表达。

mRNA翻译起始区二级结构优化提高(R)-羰基还原酶的表达及催化效率

为了提高近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCC M203011)的(R)-羰基还原酶在大肠杆菌中的表达水平及催化效率,对酶编码基因mRNA翻译起始区中+1～+78区进行二级结构的优化,并构建了相应的突变体。优化后mRNA翻译起始区的发夹结构明显减少,自由能显著下降(由原始的?9.5kcal/mol降至?5.0kcal/mol),使酶蛋白的表达水平及粗酶比活力分别比优化前提高了4～5倍和61.9%。在高底物浓度(5.0g/L2-羟基苯乙酮)下,优化突变株不对称转化效率较高,产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度和产率分别为93.1%e.e.和81.8%,比优化前提高了27.5%和40.5%。研究结果表明:优化mRNA翻译起始区的二级结构,克服蛋白翻译启动的空间位阻,不仅能促进翻译的顺利进行,使目标蛋白得到高效表达,而且有利于蛋白空间结构的正确折叠,有效提高酶蛋白活力及生物催化功能。

新型冠状病毒基因组5'非翻译区内部核糖体进入位点的生物信息学初探

目的初步探索新型冠状病毒(SARS-CoV-2)基因组5'非翻译区(5'UTRs)中的内部核糖体进入位点(IRESs),分析其翻译机制。方法对SARS-CoV-2基因组5'UTR进行序列比对和GC含量分析,用Mfold软件模拟RNA二级结构,用IRESfinder和IRESpy软件预测IRESs,并结合二级结构特征分析其翻译机制。结果SARS-CoV-2基因组5'UTR中均含有IRESs。结合茎环结构特征,判断其IRESs属于第三类或第四类病毒IRESs,在真核起始因子和IRES反式作用因子的帮助下能直接招募核糖体。结论SARS-CoV-2基因组中存在的IRES元件提示,SARS-CoV-2基因组可通过帽子依赖和非帽依赖两种机制起始翻译,大量抢夺宿主细胞的蛋白质表达系统,在完成自身病毒颗粒复制的同时阻断宿主细胞的生长。

基于mRNA 5’端TIR区二级结构优化提高重组sTNFαRI在大肠杆菌中的表达水平

目的：通过优化PET11b-s TNFαRI 5＇mRNA翻译起始区（TIR）二级结构从而提高可溶性肿瘤坏死因子I型受体（sTNFαRI）在大肠杆菌[E.coli BL21（DE3）]中的表达水平。方法：通过对PET11b-s TNFαRI mRNA 5＇端TIR区二级结构的自由能及核苷酸位置熵分析,设计相应的引物对mRNA 5＇翻译起始区（TIR）相应密码子进行突变,从而使核糖体结合位点（RBS）及起始密码子（AUG）暴露于发夹结构之外,此外将p ET11b核糖体结合位点由GAAGGAGA突变为GAAGAA,以利于翻译复合体的组装以及翻译起始。通过基因克隆的方法将5＇端TIR区优化后的序列与s TNFαRI序列一起克隆到p ET11b载体中,并转化大肠杆菌BL21（DE3）,阳性转化子经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测。结果：通过对PET11b-s TNFαRI 5＇TIR mRNA二级结构优化,经SDS-PAGE和Western blot分析表明重组s TNFαRI的表达水平较优化前提高50%~60%。结论：通过对重组载体翻译起始区（TIR）mRNA序列的二级结构优化可以有效提高目的蛋白的表达水平,对进一步工业化生产具有重要的应用价值。