trap基因表达在表皮葡萄球菌生物膜形成及附属基因调节(agr)系统活化中的作用

目的研究表皮葡萄球菌trap基因表达与生物膜形成的相关性及其对agr系统的活化作用。方法采用微量板半定量法检测表皮葡萄球菌生物膜表型,二维电泳和高灵敏度的基质辅助激光解吸附飞行时间质谱分析比较表皮葡萄球菌标准株蛋白质表达谱,实时定量逆转录PCR检测trap基因和RNAⅢ的转录水平,CLUSTAL X对表皮葡萄球菌trap基因与金黄色葡萄球菌序列进行分析,Mega软件构建进化树。结果比较分析形成生物膜的表皮葡萄球菌ATCC 35984株与不形成生物膜的ATCC 12228株生长中期的蛋白质组,发现ATCC 35984株的TRAP蛋白量明显高于ATCC 12228株。转录水平的检测显示ATCC 12228株和生物膜阳性临床SE1457、SE671株的trap基因均低转录,但RNAⅢ的转录水平未降低。SE1457株agr系统突变后,RNAⅢ的转录明显降低,trap基因的转录无变化。RNAⅢ的转录随细菌生长变化而增加,trap基因转录保持不变。trap序列分析显示其在表皮葡萄球菌与金黄色葡萄球菌中较为保守,但存在明显的进化距离。结论在本论文所研究的表皮葡萄球菌菌株中,trap基因的转录和翻译与细菌生物膜的形成不存在直接的调控相关性;并提示TRAP蛋白不是表皮葡萄球菌agr系统活化所必需的细菌产物;表皮葡萄球菌trap基因序列与金黄色葡萄球菌之间存在差异,可能与其功能差异相关。

我国羊巴贝斯虫trap基因结构及遗传进化分析

本研究拟解析我国羊巴贝斯虫trap基因的结构特征,并以其为分子标志开展遗传进化分析,为理清我国羊巴贝斯虫的分类关系提供数据。用公布的巴贝斯虫trap基因序列BLAST两个羊巴贝斯虫全基因组本地数据库,以获得的保守序列片段为模板,设计PCR引物;克隆我国分离的6株羊巴贝斯虫trap基因全长序列,分析其序列结构特征;比对序列相似性,构建系统发生树,分析其遗传进化关系。结果克隆获得6株羊巴贝斯虫trap基因,分析结果显示,其具有3、4、5个内含子的三种内含子数目,预测的开放阅读框(ORF)大小分别为1 944、2 100/2 142和2 286bp;氨基酸序列分析显示,其都具有TRAP蛋白家族特征性的vWFA、TSR、跨膜域和CTD结构域;进化关系分析显示,感染我国羊的巴贝斯虫被分成3组,组内序列相似性为99.8%~100%,而组间为43.6%~74.6%。系统发生树上6株羊巴贝斯虫被分到两大枝,羊巴贝斯虫未定种和莫氏巴贝斯虫,而且莫氏巴贝斯虫又被分成两小枝。6株羊巴贝斯虫trap基因结构存在差异,但其蛋白特征性的结构域较为保守;我国分离的羊巴贝斯虫为两个种,但莫氏巴贝斯虫中可能存在两个亚种。

莫氏巴贝斯虫trap基因的克隆表达及反应原性分析

本研究以莫氏巴贝斯虫临潭株为研究对象,分别从其基因组D N A和c DNA中成功扩增trap基因全长,应用生物信息学分析软件分析验证了该基因和蛋白的结构;构建p ET-30a-trap原核表达载体,转入大肠杆菌BL21(DE3)p Lys S感受态细胞进行诱导表达;表达产物超声破碎后,对上清和沉淀进行SDS-PAG E分析。纯化可溶性的r Bm TRAP,W estern-blot分析其反应原性。结果显示,莫氏巴贝斯虫trap基因具有4个内含子和5个外显子,开放阅读框大小为2 100 bp。第1~23位氨基酸为信号肽序列,第45~201和第238~302位分别为TRAP蛋白家族的v WA和TSP1结构域;重组蛋白r Bm TRAP以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在,莫氏巴贝斯虫临潭株、天祝株阳性血清可特异性识别r Bm TRAP,而与莫氏巴贝斯虫宁县株和河北株、羊巴贝斯虫未定种新疆株和敦煌株、吕氏泰勒虫和羊无浆体阳性血清无交叉反应。结果表明,r Bm TRAP具有作为血清学诊断方法候选抗原的潜力,为将来建立鉴别诊断莫氏巴贝斯虫临潭株、天祝株感染的免疫学诊断方法奠定了基础。

羊巴贝斯虫未定种trap基因的克隆表达及反应原性分析

通过克隆trap基因，在原核表达系统中进行表达并纯化，Westernblot鉴定TRAP蛋白反应原性，应用生物信息学分析软件分析验证该基因／蛋白的结构。以羊巴贝斯虫未定种新疆株gDNA和cDNA为模板扩增trap基因全长；并构建pET-30a-trap原核表达载体。将构建成功的表达载体转入BL21（DE3）pLysS进行诱导表达；纯化可溶性的rBspTRAP，Westernblot分析其反应原性，并应用生物信息学分析软件分析验证该基因／蛋白的结构。结果显示：获得的traP基因全长为2338bp，开放阅读框大小为1944bp，具有5个内含子和6个外显子。氨基酸序列分析显示1～26位氨基酸为信号肽序列，45～201位和240～288住氨基酸分别为TRAP蛋白家族的vWA和TSPl结构域。Westernblot结果显示羊巴贝斯虫未定种新疆／敦煌株阳性血清可特异性识别rBspTRAP，该重组蛋白与莫氏巴贝斯虫（临潭株、天祝株、河北株、宁县株）阳性血清及尤氏泰勒虫阳性血清无交叉反应。本试验成功克隆trap基因并表达，该基因可以作为免疫学诊断用候选抗原，为以后建立鉴别诊断莫氏巴贝斯虫和羊巴贝斯虫感染的免疫学诊断方法奠定基础。

皮肤鳞状细胞癌组织中TRAP的表达分析

目的：探讨端粒酶的调节基因TRAP在皮肤鳞癌中的表达情况。方法：用免疫组化s—P法检测TRAP在58例皮肤鳞癌、15例正常皮肤中的表达。结果：TRAP在皮肤鳞癌的表达明显高于正常皮肤（P〈0．01），在高、中、低三组不同分化的皮肤鳞癌的差异有统计学意义（P〈0．01），在高分化鳞癌与中分化鳞癌间的差异无统计学意义，而低分化鳞癌分别与高分化鳞癌和中分化鳞癌间的差异有统计学意义。结论：TRAP的异常高表达可能与皮肤鳞癌的发病有关，也与皮肤鳞癌的分化程度、恶性程度有关。