荧光法研究琥珀酸曲格列汀与牛血清白蛋白的相互作用及分析应用

琥珀酸曲格列汀(QGLT)是一种新型降糖药,基于其能够猝灭牛血清白蛋白(BSA)的荧光,用荧光法研究了两者的相互作用。对影响荧光猝灭的因素如溶液酸度、介质性质等进行了优化。猝灭机理探讨发现QGLT主要通过静态猝灭降低BSA的荧光,并推导出两者的结合位点数为n=1,结合常数分别为4.529×104 L·mol-1(298k)和2.958×104 L·mol-1(303k)。热力学参数测定结果显示吉布斯自由能变、焓变和熵变均为负值,表明QGLT和BSA的结合主要是通过氢键与范德华力自发结合的。研究中发现LineweaverBurk方程具有良好的线性关系,线性方程为:(F0-F)-1=2.711×10-4+3.51×10-3 cQGLT-1(cQGLT:μg·mL-1),r=0.998 9,检出限为0.13μg·mL-1(S/N=3),线性范围为0.5~10.0μg·mL-1。回收率实验结果表明方法的准确性较好(回收率为94.0%~97.5%)。用该方程测定了药片和人血清中QGLT含量,结果令人满意。本研究拓展了QGLT含量测定的新方法。

气相色谱法测定琥珀酸曲格列汀原料药中6种残留溶剂

本文提出了用气相色谱法测定琥珀酸曲格列汀原料药中6种残留溶剂的方法。采用毛细管色谱柱DB-624(30 m×0.32 mm×1.8μm)、程序升温方式,载气为N 2,检测器为氢火焰离子化检测器,分流比为10∶1。方法学验证结果表明残留溶剂乙醇、异丙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺可以很好分离,6种溶剂的平均回收率为96.40%~100.9%,检测限和定量限远远低于“人用药品注册技术要求国际协调会议”规定的限量浓度,方法的精密度与溶液稳定性均满足测定要求。本方法可作为琥珀酸曲格列汀原料药中残留溶剂的有效测定方法。

LC-MS/MS法测定人血浆中曲格列汀的浓度及2种片剂药动学比较研究

目的建立测定人血浆中曲格列汀浓度的LC-MS/MS法,考察空腹和餐后条件下2种琥珀酸曲格列汀片的人体药动学特征,并初步评价其生物等效性。方法空腹8例健康受试者和餐后8例健康受试者,采用单中心、单剂量、随机、开放、双周期、双交叉试验设计,受试者单次口服琥珀酸曲格列汀片受试制剂100 mg和参比制剂(Zafatekl■)100 mg,清洗期18 d,用LC-MS/MS法测定血浆中曲格列汀的浓度,用WinNonlin7.0软件按非房室模型计算药动学参数,评价受试药物和参比药物的生物等效性。结果空腹试验受试制剂和参比制剂主要药动学参数:Tmax分别为(2.31±1.0)、(1.34±0.94)h;Cmax分别为(0.6±0.2)、(0.56±0.1)mg/L;AUC0-t分别为(6.25±1.16)、(6.14±1.08)(mg·h)/L;AUC0-∞分别为(6.34±1.17)、(6.22±1.09)(mg·h)/L。餐后试验受试制剂和参比制剂主要药动学参数:Tmax分别为(1.69±0.73)、(2.19±1.3)h;Cmax分别为(0.58±0.18)、(0.56±0.18)mg/L;AUC0-t分别为(6.28±0.97)、(6.45±0.95)(mg·h)/L;AUC0-∞分别为(6.37±0.96)、(6.56±0.94)(mg·h)/L。空腹试验受试制剂和参比制剂Cmax、AUC0-t、AUC0-∞的几何均值比90%置信区间分别为83.64%~129.13%、95.18%~108.54%和95.23%~108.84%。餐后试验受试制剂和参比制剂Cmax、AUC0-t、AUC0-∞的几何均值比90%置信区间分别为82.41%~131.22%、92.85%~101.92%和92.54%~101.71%。结论所建立的LC-MS/MS法能快速、准确测定人血浆中曲格列汀的浓度;两制剂在本试验空腹及餐后给药条件下Cmax不具有生物等效性。

曲格列汀诱导高糖条件下肾系膜细胞表达HO-1

目的:观察曲格列汀在高糖条件下对人肾系膜细胞(HRMCs)表达血红素氧合酶1(HO-1)的影响,并初步探讨其分子机制。方法:在正常浓度(5 mmol/L)葡萄糖及高糖(25 mmol/L)条件下培养HRMCs,分别加入1、5和10μmol/L曲格列汀作用8~24 h。随后用RT-qPCR以及Western blot分别检测HO-1的mRNA和蛋白表达,比色法测定HO-1酶活性。此外,采用荧光探针检测细胞内活性氧簇(ROS)的变化,Western blot检测Akt磷酸化水平和核转录因子E2相关因子2(Nrf2)的表达水平。结果:高糖条件下HRMCs中HO-1的表达以及酶活性水平轻微增高,而经1、5和10μmol/L曲格列汀作用后,HO-1的mRNA、蛋白表达以及酶活性显著增高(P<0.05);同时,曲格列汀也能增加高糖条件下HRMCs的ROS水平并诱导Akt磷酸化,采用ROS清除剂NAC以及PI3K/Akt抑制剂LY294002处理后,HO-1的表达水平明显降低;此外,曲格列汀也可增强HRMCs核内转录因子Nrf2的表达,且NAC和LY294002能抑制曲格列汀诱导的Nrf2的表达。而沉默Nrf2后,曲格列汀诱导的HO-1表达减少。结论:曲格列汀可能能通过ROS和PI3K/Akt途径激活Nrf2而增加高糖条件下HRMCs表达HO-1。

曲格列汀改善高糖条件下人脐静脉内皮细胞氧化应激水平

目的:观察曲格列汀在高糖条件下对人脐静脉内皮细胞氧化应激水平的影响,并初步探讨其分子机制。方法:在正常葡萄糖浓度(5 mmol/L)及高糖(25 mmol/L)条件下培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),并在此期间分别加入1、5、10μmol/L曲格列汀作用24 h。随后CCK-8实验测定细胞增殖情况,荧光探针检测细胞内活性氧(ROS)变化,RT-qPCR以及Western blot分别检测NAD(P) H氧化酶和Nrf2及相关基因HMOX和NQO1的mRNA或蛋白表达水平以及内质网应激相关分子Bip1/Grp78、PDI、Ero1-Lα、Calnexin、IRE-1α和p-eIF2α表达的变化。结果:1、5和10μmol/L曲格列汀作用细胞24 h并不能降低其活性,但可有效降低高糖调剂下细胞内的ROS水平。曲格列汀处理也能明显抑制NAD(P) H氧化酶p22phox亚基mRNA的表达,并能抑制细胞核内核转录因子Nrf2的水平以及上调氧化应激相关基因HMOX和NQO1的表达。此外,高糖条件下内质网应激相关分子Bip1/Grp78、PDI、Ero1-Lα、Calnexin、IRE-1α和p-eIF2α表达水平明显增高,给予曲格列汀处理后,这些分子表达水平明显减少。结论:曲格列汀能增加高糖条件下人脐静脉内皮细胞Nrf2相关基因的表达并减轻内质网应激水平。

琥珀酸曲格列汀对糖尿病模型小鼠胆汁酸代谢的影响

目的 探讨琥珀酸曲格列汀对2型糖尿病(T2DM)胆汁酸代谢的影响。方法 将18只db/db小鼠随机分成模型对照组、琥珀酸曲格列汀组、磷酸西格列汀组,每组6只,C57小鼠6只为对照组。琥珀酸曲格列汀组给药剂量为17.29 mg·kg^(-1),每周1次,磷酸西格列汀组剂量为16.71mg·kg^(-1)·d^(-1),连续给药8周。苏木精-伊红(HE)染色观察各组小鼠的胰腺和肾脏组织病理状态;Real-time PCR和Western blotting法测定小鼠肝脏CYP7A1、法呢醇X受体(FXR)和小异二聚体伴侣(SHP)的mRNA和蛋白表达水平;基于靶向代谢组学检测小鼠回肠内容物中69种胆汁酸的含量。结果 与模型对照组比较,琥珀酸曲格列汀组和磷酸西格列汀组胰腺和肾脏组织病理状态改善;琥珀酸曲格列汀组和磷酸西格列汀组CYP7A1 mRNA和蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05);琥珀酸曲格列汀组FXR mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.05或P<0.01),而磷酸西格列汀组FXR mRNA和蛋白表达水平无明显变化(P>0.05);琥珀酸曲格列汀组SHP mRNA和蛋白表达水平有升高趋势,但差异无统计学意义(P>0.05),磷酸西格列汀组对SHP mRNA和蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05);琥珀酸曲格列汀组去甲胆酸(NCA)、猪脱氧胆酸(HDCA)、牛磺猪去氧胆酸(THDCA)和α-鼠胆酸(αMCA)显著下调,牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)显著上调;磷酸西格列汀组NCA、HDCA、αMCA、THDCA、牛磺脱氧胆酸(TDCA)和牛磺α-鼠胆酸(TαMCA)显著下调。结论 琥珀酸曲格列汀可增加db/db小鼠FXR和SHP的表达,可能是因为上调TCDCA并下调了NCA和αMCA。

琥珀酸曲格列汀对db/db小鼠CYP450酶和药物转运体的影响

目的探讨琥珀酸曲格列汀对db/db小鼠肝组织中2种主要的CYP450酶(CYP3A4、CYP2D6)和3种药物转运体(GLUT2、MRP2、NTCP)的表达水平的影响。方法将18只db/db小鼠随机分成模型对照组、琥珀酸曲格列汀组、磷酸西格列汀组,6只C57小鼠为正常对照组。琥珀酸曲格列汀组每周灌胃给予琥珀酸曲格列汀17.29 mg·kg^(-1),磷酸西格列汀组灌胃给予磷酸西格列汀16.71 mg·kg^(-1)·d^(-1),连续给药8周。苏木精-伊红(HE)染色观察琥珀酸曲格列汀对db/db小鼠肝组织病理学是否有改善作用;酶联免疫吸附测定实验(ELISA)法测定各组糖化血红蛋白水平以评价db/db小鼠的糖化血红蛋白是否相对于C57健康小鼠升高,并探讨琥珀酸曲格列汀能否降低糖化血红蛋白;采用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(RT-PCR)和Western blotting法检测各小鼠肝组织中CYP3A4、CYP2D6、GLUT2、MRP2和NTCP的mRNA水平和蛋白表达情况。结果与模型对照组比较,琥珀酸曲格列汀组肝组织病理状态改善,肝细胞空泡变性减轻;CYP3A4 mRNA表达水平无明显差异(P>0.05),而CYP3A4蛋白表达水平显著升高(P<0.01);CYP2D6 mRNA和蛋白表达水平无明显差异(P>0.05);GLUT2 mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.01);MRP2 mRNA和蛋白表达水平无明显差异(P>0.05);NTCP mRNA表达水平无明显差异(P>0.05),而NTCP蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。结论琥珀酸曲格列汀可增加db/db小鼠的CYP3A4、GLUT2和NTCP的表达,而对CYP2D6和MRP2的表达无影响。

曲格列汀联合甘精胰岛素对血糖控制不佳的T2DM患者胰岛β细胞功能和血糖波动的影响

目的探讨曲格列汀联合甘精胰岛素对血糖控制不佳的T2DM患者胰岛β细胞功能和血糖波动的影响。方法通过对我院2014年6月至2017年2月内分泌科就诊治疗的86例血糖控制不佳的T2DM患者临床资料做回顾性分析,并根据治疗方式的不同分为观察组、对照组(即观察组采用曲格列汀联合甘精胰岛素治疗、对照组采用格列美脲联合甘精胰岛素治疗各43例),通过动态CGMS监测血糖波动情况,并比较血糖、血脂、血压、HOMA-β及HOMA-IR等指标变化。结果两组患者治疗后FPG、2h PG等生化指标均较治疗前好转,差异有统计学意义(P<0.05),且两组患者治疗后血糖、血脂、血压、胰岛素用量等指标比较差异无统计学意义(P>0.05)。两组患者治疗前各CGMS指标比较差异无统计学意义(P>0.05),治疗后观察组MAGE、NGE、MODD值、高血糖AUC均较对照组下降明显,差异有统计学意义(P<0.05),两组患者SDBG、低血糖AUC比较差异无统计学意义(P>0.05)。两组患者治疗前HOMA-β、HOMA-IR指数比较差异无统计学意义(P>0.05),治疗后两组患者HOMA-β指数均较治疗前升高,且观察组较对照组上升明显,差异有统计学意义(P<0.05);治疗后HOMA-IR指数均较治疗前下降,且观察组较对照组下降明显,差异有统计学意义(P<0.05)。结论曲格列汀联合甘精胰岛素治疗血糖控制不佳的T2DM患者可有效的调节其血糖,改善血糖波动及胰岛β细胞功能,在血糖控制稳定性方面临床疗效显著,且未见明显低血糖事件发生。

高效液相色谱法测定琥珀酸曲格列汀片的含量

目的建立琥珀酸曲格列汀片含量测定的高效液相色谱方法。方法采用安捷伦C18（250mm×4.6mm,5μm）色谱柱;以甲醇-0.05mol·L-1磷酸二氢钾缓冲液（取磷酸二氢钾6.8g,加水溶解并稀释至1000m L,加三乙胺2m L,用磷酸调节p H值至5.5）（30∶70）为流动相,流速：1.0m L·min-1,检测波长277nm。结果琥珀酸曲格列汀的线性范围为20-200μg·m L-1,r=1.0000,平均回收率为99.5%,RSD为0.58%（n=9）。结论该方法简便灵敏、结果准确,适用于琥珀酸曲格列汀片的质量控制。

正相高效液相色谱法测定琥珀酸曲格列汀中的(R)-3-氨基哌啶

建立琥珀酸曲格列汀中(R)-3-氨基哌啶测定的正相高效液相色谱分析方法,用于琥珀酸曲格列汀中对起始原料(R)-3-氨基哌啶盐酸盐残留的质量控制。采用CHIRALPAK AD-H(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,以正己烷-无水乙醇(80:20)为流动相,等度洗脱,流速为1.0 mL/min;柱温为30℃;检测波长为210 nm。(R)-3-氨基哌啶在0.10~3.03μg/mL范围与峰面积呈良好的线性关系,r=0.9993;检测限为0.03048μg/mL,加标平均回收率100.5%(n=15)。本文建立的方法准确、灵敏、可靠,适用于琥珀酸曲格列汀中杂质(R)-3-氨基哌啶含量的检测。

琥珀酸曲格列汀合成路线改进

本文对琥珀酸曲格列汀的合成路线进行了改进。用2-氰基-5-氟苄醇代替刺激性强、对人伤害大的2-氰基-5-氟苄溴,并采用"一锅煮"法合成中间体1,简化了操作。本文描述工艺为工业放大提供了一条可行的路线。

琥珀酸曲格列汀的合成工艺研究

目的:对琥珀酸曲格列汀的合成路线进行工艺优化。方法:以4-氟-2-甲基苯甲腈为起始原料,经溴代、缩合、取代、成盐4步反应,得到目标产物琥珀酸曲格列汀。结果:通过优化后的合成工艺,总收率可达47.1%,纯度达到99.90%以上。结论:改进后的合成工艺反应条件温和,操作简便,经济环保,更适合工业化生产。

DPP-4抑制剂曲格列汀治疗2型糖尿病的临床应用评价

目的研究2型糖尿病通过DPP-4抑制剂曲格列汀来进行治疗,所取得的临床应用效果,并对其进行评价。方法通过对我国以及外国曲格列汀对2型糖尿病患者治疗的文献进行检索,将曲格列汀的各个方面的临床应用进行研究和评价。结果 2型糖尿病患者通过1次/周口服曲格列汀来进行治疗和1次/d服用1次阿格列汀来进行治疗,2种药物取得的治疗效果大致相同;2型糖尿病患者通过服用100 mg的曲格列汀,最长的达峰时间为1.3 h,3 d内的半衰期平均为18.5 h,7 d内的半衰期平均为54.3 h,患者均没有产生明显的蓄积效应;通过曲格列汀治疗,空腹时的血糖浓度均得到明显的降低效果,用食2 h后,患者的血糖浓度与用药时曲线下面积(AUC)得到显著改善,曲格列汀的剂量与效果呈正比;服用曲格列汀后体内的的糖化血红蛋白(HbA1c)含量明显改善;Ⅱ期剂量研究:患者通过服用剂量依次增加的曲格列汀,不良反应概率达到:37%、39%、40%、50%、51%,不良反应最常见为鼻咽炎,鼻咽炎的程度大多是轻度到中度,其中服用50 mg药量的患者中小肠结肠炎患者2例,服用200 mg药量的患者中糖尿病坏疽患者有2例,Ⅲ期验证研究:常见不良症状依旧是轻度或中度鼻咽炎。结论 2型糖尿病患者通过服用DPP-4抑制剂曲格列汀,药物疗效显著,该药在临床上的应用具有重要意义。

琥珀酸曲格列汀干法制粒工艺参数探索

目的研究琥珀酸曲格列汀干法制粒工艺参数。方法以颗粒的流动性和可压性为评价指标,采用单因素筛选和正交试验筛选干法制粒工艺参数。结果筛选出的干法制粒工艺参数为:水平进料速度10 r·min^(-1)、垂直进料速度400 r·min^(-1)、压轮压力16 kN·cm^(-1)、压轮间隙1.5 mm、压轮转速3 r·min^(-1)。结论优选的干法制粒工艺参数稳定可行,可用于琥珀酸曲格列汀的制粒。

曲格列汀琥珀酸盐晶体结构和晶型稳定性研究

采用重结晶方法和混悬方法研究曲格列汀琥珀酸盐在极性溶剂(水和95%乙醇)中的转晶情况。采用X射线单晶衍射、X射线多晶衍射和热分析等多种分析方法,对曲格列汀琥珀酸盐转晶前后的结晶形式进行了结构表征。结果表明,曲格列汀琥珀酸盐在溶剂介导下特别是极性溶剂介导下容易转化成曲格列汀半琥珀酸盐。

琥珀酸曲格列汀及其有关物质的UPLC Orbitrap HRMS法测定

建立了超高效液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC Orbitrap HRMS)法测定琥珀酸曲格列汀(1)原料药及其中间体2以及位置异构体3。采用Eclipse Plus-C_(18)色谱柱,以0.05 mol/L的乙酸铵缓冲液∶乙腈(45∶55)为流动相。质谱采用加热电喷雾离子源,正离子扫描模式,扫描范围m/z 200~500,监测离子分别为[M+H]^+m/z 358.167±0.003(1)、[M+H]^+m/z 294.044±0.003(2)、[M+H]^+m/z 358.167±0.003(3)。1琥珀酸盐在100~5 000 ng/ml范围内线性关系良好,有关物质2和3在1~50 ng/ml范围内线性关系良好,平均回收率分别为99.48%、97.51%和97.22%,RSD分别为1.63%、1.94%和2.17%;检测限均为0.01 ng/ml。本法定性可靠,定量准确,灵敏度高。

琥珀酸曲格列汀有关物质的合成

目的为了更好地对琥珀酸曲格列汀的原料药进行质量控制,合成琥珀酸曲格列汀的有关物质。方法以1-甲基巴比妥酸为起始原料,经氯代、取代反应得到有关物质A,A再经缩合,取代制得有关物质B,B再经一步反应得到有关物质C。结果与结论有关物质A、B、C的结构经1H-NMR和MS谱确证,本文首次报道了有关物质B和C的合成路线,该路线反应条件温和、操作简单。合成的有关物质可以作为琥珀酸曲格列汀原料药质量控制的对照品。

琥珀酸曲格列汀的合成及初步HPLC质量控制研究

目的对琥珀酸曲格列汀的合成工艺进行系统研究,为其工艺放大奠定基础。方法以6-氯-3-甲基尿嘧啶为起始原料,通过2次亲核取代、氯化氢-甲醇溶液脱Boc,再与琥珀酸成盐制得琥珀酸曲格列汀。针对采用的特定路线,制备了5种主要有关物质的标准品。结果与结论选用(R)-3-Boc-氨基哌啶引入氨基侧链,可位置选择性地合成曲格列汀,4步反应的总收率达43.1%(以6-氯-3-甲基尿嘧啶计),终产物的纯度达到99.5%以上,单个杂质量均控制在0.1%以下。建立了琥珀酸曲格列汀合成所涉及的各步中间体、目标物及其有关物质的HPLC检测方法,并运用此方法进行合成过程控制及产品质量评价。

LC-MS/MS法测定人血浆中曲格列汀的浓度及其药代动力学研究

目的建立LC-MS/MS法测定人血浆中曲格列汀的浓度,并将其用于琥珀酸曲格列汀片的人体药代动力学研究。方法以胍法辛为内标,血浆样品经蛋白沉淀法处理后进样。色谱柱:Ultimate? XB-C18(2.1 mm×100 mm,3μm,Welch);流动相:含0.1%甲酸的水溶液(A)-纯甲醇(B);梯度洗脱;流速:0.5 mL·min-1;进样量:10μL。结果曲格列汀在2~600 ng·mL-1线性关系良好,准确度、精密度、提取回收率、稳定性均符合接受标准,且该方法不受基质效应的影响,无残留效应。结论本文的分析方法简单、快速、灵敏,该方法成功用于中国健康受试者单次空腹口服琥珀酸曲格列汀片100 mg后的人体药代动力学研究。

新型降血糖药曲格列汀的研究进展

糖尿病已经成为严重威胁人类生命健康的慢性病之一。传统降血糖药往往存在血糖控制不稳定、容易诱发多种不良反应、患者用药依从性差等问题。因此,近年来,基于新靶点的降血糖药的研发和应用越来越受到人们的重视。其中,曲格列汀作为全球第一款批准上市的超长效二肽基肽酶-4(dipeptidyl peptidase-4 inhibitor,DPP-4)抑制剂,因其具有疗效稳定、不良反应少、患者依从性好等优点而备受关注。该文从作用机制、药动学、药效学、临床应用研究、安全性评价等方面对曲格列汀进行综述,以期为其临床合理应用提供参考。