多穗柯三叶苷的抑制糖尿病关键酶活性和抗氧化性

从多穗柯中提取分离得到三叶苷,以抗糖尿病药物阿卡波糖为阳性对照,检测多穗柯三叶苷对小肠α-葡萄糖苷酶和胰脏α-淀粉酶活性的抑制作用和对α-葡萄糖苷酶活性抑制类型,并以芦丁为阳性对照检测其清除DPPH自由基能力。结果显示:多穗柯三叶苷对α-葡萄糖苷酶有明显抑制作用,为非竞争性抑制,抑制效果与阿卡波糖无明显差别,对α-淀粉酶活性的抑制率低于阿卡波糖;清除DPPH自由基能力强于芦丁。表明多穗柯三叶苷是一种有应用潜力的抗糖尿病活性物质。

野生多穗柯主要活性成分及其含量变化

为了充分利用野生多穗柯资源,并对其人工定向培育提供科学依据,采用高效液相色谱法(HPLC),对广西田林、巴马、德保和那坡产的野生多穗柯中含量高且具有重要生物活性的根皮苷和三叶苷等指标进行测定。高效液相色谱条件为乙腈-0.04%甲酸(28∶72)等度洗脱,流速0.8 m L/min,检测波长285 nm。结果表明,根皮苷和三叶苷含量的线性关系良好。广西产的野生多穗柯,同一植株上的嫩叶和老叶中2种活性成分的含量变化具有一定的规律性:从嫩叶到老叶,根皮苷含量增加,三叶苷含量却大幅度下降;三叶苷和根皮苷总含量较高的3株多穗柯样品分别为DB-26、TL-08和BM-03的嫩叶,其总含量分别为21.73%、21.21%和19.39%。

三叶苷对下肢缺血再灌注小鼠肾损伤的保护作用

目的探讨三叶苷(trilobatin,TLB)减轻下肢缺血再灌注(lower-limb ischemia reperfusion,LIR)所致的肾损伤及其机制。方法制备LIR模型,将C57BL6小鼠随机分为4组:对照组(不进行LIR模型制备)、损伤组(建立LIR模型)、预处理组(预先给予TLB,再建立LIR模型)、抑制剂组(预先给予SIRT3选择性抑制剂,再给予TLB,之后建立LIR模型)。LIR后,抽取外周血并分离肾组织,HE染色观察肾组织病理学改变及损伤评分,生化分析仪检测血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平,DHE染色检测肾组织中活性氧(ROS)水平,相应试剂盒检测外周血丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量,Western blot检测肾组织中沉默信息调节因子3(SIRT3)/超氧化物歧化酶2(SOD2)信号通路的蛋白表达情况。结果与对照组相比,损伤组肾组织病理学损伤评分增高,外周血中Scr、BUN和肾组织中ROS、MDA升高,肾组织中SOD降低,SIRT3、SOD2表达水平下调(P均<0.05);与损伤组比较,预处理组肾组织病理学损伤评分、Scr、BUN、ROS、MDA降低,SOD升高,SIRT3、SOD2表达水平上调(P均<0.05);与预处理组比较,抑制剂组肾组织病理学损伤评分、Scr、BUN、ROS、MDA升高,SOD下降,SIRT3、SOD2表达水平下调(P均<0.05)。结论三叶苷预处理可减轻下肢缺血再灌注的氧化应激反应,改善肾损伤,其机制可能与激活SIRT3/SOD2通路有关。

木姜叶柯红茶的提取条件优选研究

该研究选用L_9(3~4)正交试验对木姜叶柯红茶的提取条件如加水量、提取次数和提取时间进行了考察,选用三叶苷、根皮苷和多酚作为评价指标进行加权评分方差分析,以探索最佳提取的工艺参数。研究确定提取工艺条件优选为A1B3C2D1,即取红茶5g,加水量为300m L,提取3次,提取时间为20min;按以上条件进行3次验证实验,结果表明,该工艺条件下根皮苷的提取转移率为90.53%,三叶苷的提取转移率为89.97%,多酚的提取转移率为90.69%。该实验提供了对木姜叶柯红茶的提取方法,并验证了方法对提取主要成分的稳定性,为木姜叶柯红茶的开发利用提供参考借鉴。

SIRT3/FoxO3a通路参与三叶苷预处理保护下肢缺血再灌注继发的肺损伤

目的基于SIRT3/FoxO3a通路探讨三叶苷(TLB)预处理能否减轻下肢缺血再灌注(IR)继发的肺损伤及其具体机制。方法制备下肢IR模型,50只小鼠随机分为5组,即假模型组(Control组)、缺血再灌注组(IR组)、三叶苷组(TLB+IR组)、三叶苷+SIRT3抑制剂组(3-TYP+TLB+IR组)、SIRT3抑制剂组(3-TYP+IR组)。模型建立后,抽取动脉血进行血气分析,观察肺组织病理学改变及凋亡情况,测定氧化应激指标中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)含量,以及肺组织中沉默信息调节因子3(SIRT3)、叉头框蛋白O3a(FoxO3a)蛋白表达水平。结果与Control组相比,IR组血气指标明显下降,光镜下可见肺泡形态结构破坏并伴大量炎性细胞浸润,肺组织中SOD、GSH-Px活力显著下降、MDA含量和凋亡水平明显增高(P<0.05)。TLB+IR组因三叶苷干预后,可有效改善血气指标,光镜下可见肺泡形态结构相对完整,肺损伤评分相对降低,肺组织氧化应激损伤和凋亡水平相对减轻,SIRT3/FoxO3a信号通路激活(P<0.05)。3-TYP+TLB+IR组应用SIRT3特异性抑制剂(3-TYP)抑制SIRT3信号通路后,三叶苷的保护作用明显减弱(P<0.05)。而3-TYP+TLB+IR组与3-TYP+IR组指标差异无统计学意义。结论三叶苷预处理可减轻氧化应激反应,改善下肢缺血再灌注继发的肺损伤,其机制可能与调节SIRT3/FoxO3a通路有关。

多穗柯三叶苷对脂多糖诱导小鼠炎症反应的保护作用

探讨多穗柯三叶苷对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的小鼠炎症反应的抗炎症作用。以3、30、300 mg/(kg·d)3个剂量组的多穗柯三叶苷灌胃小鼠3 d后,腹腔注射0.1 mg/kg LPS,观察三叶苷预处理对LPS诱导的炎症因子表达的影响。酶联免疫反应测定小鼠血清中炎症因子肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的含量,实时定量聚合酶链式反应法检测肝组织中TNF-α和IL-6的m RNA水平,免疫组织化学染色检测小鼠肝组织中TNF-α和IL-6蛋白水平。结果表明,3 mg/(kg·d)三叶苷剂量组可显著抑制LPS诱导的小鼠血清中TNF-α和IL-6的分泌,降低肝组织中TNF-α和IL-6的表达水平。多穗柯三叶苷对小鼠的炎症反应具有一定的保护作用。

木姜叶柯中根皮苷与三叶苷含量测定研究

目的测定15份木姜叶柯样品中根皮苷与三叶苷的含量并比较其差异。方法采用高效液相色谱(HPLC)法,色谱柱为Phenomenex Gemini C_(18)柱(250 mm×4.6 mm,5μm),检测波长为280 nm,流动相为乙腈-水(0.1%的磷酸),梯度洗脱,流速为1.0 m L/min。结果根皮苷进样量在0.250～5.000μg范围内与峰面积相关性较好,回归方程为C=0.000 603 A-0.021,r=0.999 8(n=7);三叶苷进样量在0.575～5.750μg范围内与峰面积相关性较好,回归方程为C=0.000 470 A-0.041,r=0.999 6(n=7)。15份木姜叶柯样品中根皮苷含量为0.62%～9.04%,三叶苷含量为0.30%～22.79%。结论该方法简便,结果准确可靠,可用于测定木姜叶柯中根皮苷与三叶苷含量。

三叶苷对N-甲基-D-天冬氨酸诱导的人神经母细胞瘤细胞损伤的保护作用

目的研究三叶苷(Trilobatin)对N?甲基?D?天冬氨酸(N?methyL?D?aspartate,NMDA)诱导的人神经母细胞瘤细胞(SH?SY5Y)损伤的保护作用。方法采用体外细胞培养的方法,建立SH?SY5Y细胞NMDA损伤模型。分设对照组(0 mmol/L NMDA)、NMDA损伤模型(0μmol/L三叶苷)组、三叶苷组(10,50,100μmol/L)。对照组正常培养,NMDA损伤模型组以2 mmol/L的NMDA为造模浓度,三叶苷组在NMDA损伤模型组的基础上分别以10,50,100μmol/L的三叶苷为细胞活性测试浓度。采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)测定三叶苷对SH?SY5Y细胞活性的影响;通过MTT法、乳酸脱氢酶(LDH)释放量检测三叶苷对NMDA诱导SH?SY5Y细胞损伤的保护作用,用蛋白质印迹法(Western Blot)检测细胞内促凋亡蛋白Bax,抗凋亡蛋白Bcl?2及NMDA受体调节亚单位NR2B蛋白表达水平,研究其作用机制。结果三叶苷在1~100 mmoL/L范围内不影响SH?SY5Y细胞的存活率。与对照组相比,NMDA损伤模型组细胞存活率为(53.13±3.31)%,细胞存活率明显降低,细胞凋亡明显增高。与对照组相比,三叶苷组(10,50,100μmol/L)细胞存活率分别为(56.28±2.05)%、(68.64±1.74)%及(75.98±1.84)%,细胞存活率明显增高(F=293.3,P<0.001),LDH释放量减少,细胞凋亡明显降低(F=314.1,P<0.001)。三叶苷参与调控NR2B亚单位及凋亡相关蛋白的表达,可降低NR2B蛋白与促凋亡蛋白Bax的表达,上调抗凋亡蛋白Bcl?2的表达。结论三叶苷对NMDA诱导的神经母细胞瘤SH?SY5Y细胞损伤有保护作用,其作用机制与NR2B亚单位相关。

正交试验优选木姜叶柯中三叶苷提取工艺

目的采用正交试验法优化木姜叶柯中三叶苷的提取工艺。方法以三叶苷含量为评价指标,以液料比、提取时间、提取次数为影响因素,采用L9(34)正交试验,优选木姜叶柯中三叶苷提取工艺。结果对木姜叶柯中三叶苷含量的影响强度依次为提取次数>提取时间>液料比;优选出的最佳提取工艺为液料比15∶1,提取3次,每次1. 5 h;经试验验证,平均含量为33. 89%,RSD为1. 14(n=3)。结论所优选的提取工艺稳定可靠,流程简单,提取率高,可为大规模生产提供参考。

新型功能甜味剂——三叶苷

三叶苷由于其独特的生物活性及风味特性,成为近年国际上一种新兴的功能型甜味剂,在食品领域有着广泛的应用。对三叶苷的植物来源、理化性质、分离纯化方法、检测方法及生物活性进行了综述,重点叙述了三叶苷的检测方法及生物活性,旨在为三叶苷的合理有效开发利用,提供参考依据。三叶苷具有多植物基源,在我国主要分布于木姜叶柯叶片之中,但各地样品叶片中三叶苷含量具有显著的差异,提示对此植物资源的品种与采收期仍需进行更深入的研究。木姜叶柯是一种速生乔木,在我国各地均有分布,植物资源蕴藏量大,可为三叶苷提供充足的原料基础。三叶苷具有降血糖、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等作用,甜味口感良好,有望成为继甜菊糖苷、罗汉果甜苷之后,又一天然高倍甜味剂。

超高效液相色谱-串联质谱法测定不同pH值溶液中三叶苷平衡溶解度和表观油水分配系数

目的建立超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)方法测定三叶苷含量,考察三叶苷在不同pH值缓冲液中平衡溶解度和表观油水分配系数。方法选用Kinetex XB-C18柱(100 mm×2.1 mm,2.6μm),流动相为0.1%甲酸溶液(A)/乙腈(B),采用梯度洗脱:起始B为10%并持续1.00 min;1.00~8.00 min B变为80%,并持续至12.00 min;12.01 min B变为10%并持续至15.00 min。采用摇瓶法考察三叶苷在不同pH值缓冲液中平衡溶解度及其在正辛醇-磷酸盐缓冲液中表观油水分配系数。结果三叶苷在pH值1.2,2.0,4.5,6.5,7.5,9.0,10.5,12.0缓冲液中平衡溶解度分别为0.90,1.16,1.83,2.72,3.91,11.73,15.51,23.79 mg·mL^(-1)。在pH值1.2~12.0范围内,三叶苷油水分配系数lgP值分布在-0.58~0.26。结论三叶苷为难溶性药物,其平衡溶解度和表观油水分配系数均受溶液pH值的影响,溶解度随着溶液pH值升高而明显增大,而表观油水分配系数则显著下降。

三叶苷调控miR-539-5p表达保护缺氧缺糖心肌细胞损伤研究

目的:探讨三叶苷对缺氧缺糖心肌细胞损伤的保护作用及机制。方法:采用不同浓度的三叶苷作用于缺氧缺糖诱导的心肌细胞H9C2,试剂盒检测丙二醛(MDA)含量、乳酸脱氢酶(LDH)和超氧化物歧化酶(SOD)活性,流式细胞术、蛋白质印记(Western blot)检测细胞凋亡以及B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)和Bcl相关X蛋白(Bax)蛋白表达,实时荧光定量PCR(RTq PCR)检测miR-539-5p表达。转染miR-539-5p模拟物至H9C2细胞,检测过表达miR-539-5p对缺氧缺糖诱导的H9C2细胞损伤的影响。结果:三叶苷作用于缺氧缺糖诱导的H9C2细胞后,细胞中MDA含量、LDH释放量、细胞凋亡率和Bax蛋白表达水平显著降低,SOD活性、Bcl-2蛋白和miR-539-5p表达水平显著升高(P<0.05)。过表达miR-539-5p后,缺氧缺糖诱导的H9C2细胞中MDA含量、LDH释放量、细胞凋亡率和Bax蛋白表达水平显著降低,SOD活性、Bcl-2蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。抑制miR-539-5p表达可减弱三叶苷对缺氧缺糖诱导的H9C2细胞MDA含量、LDH释放量、SOD活性、凋亡,以及Bax和Bcl-2蛋白表达的影响。结论:三叶苷可有效降低缺氧缺糖诱导的心肌细胞损伤,其机制与上调miR-539-5p表达有关。

木姜叶柯总黄酮大鼠口服吸收研究

目的研究大鼠灌胃木姜叶柯总黄酮,总黄酮中根皮苷的吸收利用及三叶苷含量对根皮苷生物利用度的影响。方法取3组大鼠,分别灌胃木姜叶柯总黄酮(含根皮苷质量分数75%、三叶苷质量分数5%),配方A(含根皮苷质量分数75%、三叶苷质量分数10%),配方B(含根皮苷质量分数75%、三叶苷质量分数20%),剂量80mg·kg-1(相当于根皮苷60mg·kg-1);另取1组大鼠静脉注射根皮苷60mg·kg-1,于给药后不同时间测定血浆根皮苷质量浓度。做血药质量浓度-时间曲线;分别以灌胃给药组血药曲线下面积(AUC)除以静脉注射给药组血药曲线下面积,计算各药根皮苷的生物利用度。结果大鼠灌胃木姜叶柯总黄酮,血浆根皮苷质量浓度最低,生物利用度只有7.8%。随着灌胃药液中的三叶苷含量增加,灌胃给药动物血浆根皮苷质量浓度和AUC明显提高。结论三叶苷可以提高木姜叶柯总黄酮中的根皮苷生物利用度。

三叶苷质量标准初步研究

目的初步研究三叶苷的质量标准。方法取木姜叶柯药材,采用热水提取及乙醇热饱和结晶制得三叶苷纯品,测定三叶苷纯品的水分,并利用碳谱、氢谱及薄层色谱鉴定其真伪。结果经上述波谱及薄层色谱鉴定,水分平均值为3. 55%,其结构为三叶苷。结论该方法可用于三叶苷质量标准的初步研究。

高效液相色谱法测定木姜叶柯中根皮苷、三叶苷和根皮素的含量

建立高效液相色谱法同时测定木姜叶柯中三叶苷、根皮苷和根皮素的含量。采用C18色谱柱;检测波长285nm,流动相为乙腈-0.04%甲酸,梯度洗脱;流速0.8mL/min;柱温40℃。三叶苷、根皮苷和根皮素的加标回收率分别为102.54%、102.01%和102.12%,RSD分别为1.66%、2.21%和2.38%。该方法适用于木姜叶柯中根皮苷、三叶苷和根皮素的含量分析,为其药材质量的判定提供数据参考。

多穗石柯叶水提物及其主要成分对PC12细胞增殖的影响

目的考察多穗石柯叶水提物及其主要成分对PC12细胞的增殖影响。方法将对数生长期的PC12细胞接种于96孔板,多穗石柯叶水提物(0、25、50、75、100、200 μg/L)、根皮苷(0、25、50、75、100、200 μM)、三叶苷(0、25、50、75、100、200 μM)及茶多酚(0、25、50、75、100、200 μM)分别作用PC12细胞72 h后采用BrdU ELISA试剂盒检测PC12细胞的BrdU相对含量以反映其促增殖的作用。结果 75~200 μg/L的多穗石柯叶水提物和75~200 μM的三叶苷可显著增加PC12细胞的BrdU相对含量,而不同浓度的根皮苷及茶多酚对PC12细胞的增殖无影响。同时经75~200 μg/L的多穗石柯叶水提物作用的PC12细胞BrdU相对含量相比于经75~200 μM的三叶苷作用的PC12细胞BrdU相对含量高。结论多穗石柯叶水提物和三叶苷均可显著促进PC12细胞增殖,而根皮苷及茶多酚则无促增殖作用。说明多穗石柯叶水提物的促增殖作用可能与三叶苷有关,但其作用机制有待于进一步研究。

三叶苷对人正常肝细胞L-02增殖作用的研究

目的探究三叶苷(TLB)促进人正常肝细胞L-02的增殖作用。方法人正常肝细胞L-02经不同浓度的TLB处理后,通过MTT法测定TLB对L-02细胞活力的影响,采用BrdU ELISA法和EDU荧光染色法分别观察L-02细胞DNA的含量和细胞增殖的改变,通过免疫印迹法分析细胞周期相关调节蛋白的表达。结果TLB(25、50、100μM)作用L-02细胞72 h能够明显增加L-02的细胞活力,并明显增加BrdU含量及EDU的荧光强度,同时TLB能够明显下调L-02细胞中HNF4α的蛋白表达,上调CDK4、cyclin D1、HGF的蛋白表达,并增加c-Met的磷酸化水平和其下游Akt、Erk1/2的磷酸化水平。结论TLB对人正常肝细胞L-02具有促增殖作用,其机制可能与调控HGF/c-Met信号途径有关。

甜茶木姜叶柯及其主要活性成分三叶苷药理作用研究进展

木姜叶柯Lithocarpus litseifolius(Hance)Chun.又名多穗石柯Lithocarpus polystachyus Rehd.,俗称甜茶,属于药食同源中药,集药、茶、食、糖多种用途于一体。木姜叶柯富含三叶苷、根皮苷、根皮素等二氢查尔酮类成分。本文综述了木姜叶柯及其主要成分三叶苷在调节糖脂代谢、抗炎、抗衰老与抗氧化应激、神经保护和保肝等药理作用方面的国内外研究进展,以期为甜茶木姜叶柯的后续研究与综合开发利用提供依据。

催化根皮素生成三叶苷的来源于穿心莲的糖基转移酶UGT74L2及其酶学研究

根皮素-4’-O糖基转移酶(P4’-OGT)是三叶苷生物合成途径中最后一步关键酶,可在体外催化根皮素生成三叶苷,但目前仅有少数P4’-OGT被鉴定。本研究利用已报道的苹果中P4’-OGT(MdPh-4’-OGT)序列对穿心莲转录组进行筛选,获得两条同源基因UGT74L2和UGT74L3。系统发育树分析表明,UGT74L2和UGT74L3与其他物种中已鉴定功能的UGT74家族聚为一类。体外酶促反应显示,UGT74L2可特异性催化根皮素生成三叶苷,而UGT74L3无产物产生。通过Ni-NTA亲和色谱纯化获得可溶性UGT74L2重组蛋白,以根皮素为底物进行酶促动力学研究。研究结果表明,UGT74L2酶促反应最适温度为40℃,最适pH值为8.0(Tris-HCl体系)。Ca^(2+)、Mn^(2+)、Co^(2+)对UGT74L2的活性有一定的抑制作用,而Mg^(2+)可提高UGT74L2的活性,其他金属离子对UGT74L2活性无明显影响。酶促动力学参数测定结果显示,K_(m)值为29.84μmol·L^(-1),kcat值为0.02 s^(-1),k_(cat)·K_(m)^(-1)值为572.6 mol^(-1)·s_(-1)。同源建模、分子对接结合突变实验结果显示,底物结合口袋中的多个氨基酸与其催化活性密切相关。本研究从穿心莲中鉴定了一条新的P4’-OGT,可为活性天然产物三叶苷的生物合成提供糖基化元件,也可为其他植物糖基转移酶的功能挖掘提供参考。

RhoA/ROCK2信号通路在三叶苷减轻大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用

目的:评价Rho亚家族蛋白A(RhoA)/Rho相关的卷曲连接蛋白激酶2(ROCK2)信号通路在三叶苷减轻大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用。方法:清洁级健康雄性SD大鼠80只,6~8周龄,体重230~280 g,采用随机数字表法分为4组(n=20):假手术组(S组)、脑缺血再灌注组(IR组)、脑缺血再灌注+三叶苷组(T组)和脑缺血再灌注+三叶苷+RhoA/ROCK2信号通路激动剂AA组(A组)。采用大脑中动脉栓塞法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型。T组和A组大鼠于缺血前3 d给予三叶苷15 mg/kg灌胃,2次/d,连续3 d,A组大鼠于每次灌胃前腹腔注射RhoA/ROCK2信号通路激动剂AA 10 mg/kg。于再灌注24 h时行神经行为学评分,随后处死大鼠取海马组织,采用流式细胞术检测海马神经元凋亡率,TTC染色确定脑梗死体积,采用Western blot法检测磷酸化RhoA(p-RhoA)、ROCK2和裂解的caspase-3(cleaved caspase-3)的表达,透射电镜下观察海马神经元超微结构。结果:与S组比较,IR组大鼠神经行为学评分和海马神经元凋亡率升高,脑梗死体积增加,p-RhoA、ROCK2和cleaved caspase-3表达上调(P<0.05),海马神经元病理学损伤加重;与IR组比较,T组大鼠神经行为学评分和海马神经元凋亡率降低,脑梗死体积减少,p-RhoA、ROCK2和cleaved caspase-3表达下调(P<0.05),海马神经元病理学损伤减轻;与T组比较,A组大鼠神经行为学评分和海马神经元凋亡率升高,脑梗死体积增加,p-RhoA、ROCK2和cleaved caspase-3表达上调(P<0.05),海马神经元病理学损伤加重。结论:RhoA/ROCK2信号通路参与了三叶苷减轻大鼠脑缺血再灌注损伤的过程,可能与抑制海马神经元凋亡有关。