追毒方逆转三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞耐药的作用机制

目的基于糖基转移酶β3GnT8探讨追毒方逆转三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞耐药的作用机制。方法通过MTT法观察追毒方对MDA-MB-231耐药细胞增殖的抑制作用,通过转染β3GnT8得到高表达β3GnT8的MDA-MB-231/TAX细胞株,采用Western blot观察糖基转移酶β3GnT8和耐药蛋白BCRP、P-gp的表达,通过凝集素流式细胞术观察转染β3GnT8MDA-MB-231/TAX细胞膜表面β3GnT8的荧光强度。结果追毒方有效成分能明显抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231耐药细胞的增殖,作用72h抑制率达到50.16%,能有效下调β3GnT8和耐药蛋白BCRP、P-gp的表达,并且β3GnT8的表达与BCRP、P-gp呈正相关。结论追毒方可通过下调糖基转移酶β3GnT8,从而降低耐药蛋白BCRP、P-gp的表达,逆转三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞耐药性。

追毒方调控c-JUN抑制糖基化异常逆转三阴性乳腺癌耐药的机制

目的从c-JUN调控的糖基化角度探究追毒方逆转三阴性乳腺癌(TNBC)耐药的机制。方法MTT检测细胞增殖,采用Western blot检测c-JUN、β3GnT8和ppGalNAc-T1/2、CD147、耐药蛋白BCRP和MDR1的表达。采用转染c-JUN质粒建立过表达c-JUN的MDA-MB-231/ADR细胞。体内实验采用耐药TNBC原位移植裸鼠模型。结果追毒方可显著抑制MDA-MB-231/ADR细胞的增殖(P<0.01),具有时效和量效关系;可明显抑制耐药TNBC原位移植裸鼠的肿瘤质量(P<0.01);降低耐药蛋白BCRP和MDR1表达(P<0.01),并同时明显降低c-JUN、β3GnT8和ppGalNAc-T1/2、CD147蛋白的表达(P<0.05)。过表达c-JUN后,与空白质粒对照组比较,β3GnT8、ppGalNAc T1/2、CD147、BCRP和MDR1的表达均显示增加(P<0.05,P<0.01)。而空白质粒对上述蛋白的表达无影响。追毒方可以显著降低过表达c-JUN后的上述蛋白的表达,但其表达水平还是显著高于空白质粒加药组(P<0.05,P<0.01)。结论追毒方通过作用于调控因子c-JUN,下调β3GnT8和ppGalNAc-T1/2的激活,从而抑制CD147的糖基化修饰,导致耐药蛋白BCRP和MDR1下调而逆转TNBC耐药。

益气小复方抑制三阴性乳腺癌外泌体传递耐药信息的作用机制研究

目的:探讨三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231)顺铂(DDP)耐药细胞株释放的外泌体(Exosomes,EXOs)在细胞间可能存在的耐药信息传递作用及益气小复方对外泌体传递耐药信息的阻滞作用。方法:以三阴性乳腺癌亲本细胞MDA-MB-231及其DDP耐药细胞(MDA-MB-231/DDP)为模型,采用过滤离心法提取MDA-MB-231/DDP外泌体(DDP-EXO);透射电子显微镜观察鉴定细胞DDP-EXO形态; Western blot检测其CD63、TSG101、CD9的表达;用激光共聚焦显微镜追踪DDP-EXO与敏感细胞MDA-MB-231的相互作用; MTT法检测MDA-MB-231与DDP-EXO共培养后对DDP的IC50的影响及益气小复方干预DDP-EXO与MDA-MB-231细胞共培养后对DDP IC50的影响。结果:透射电子显微镜下观察DDP-EXO呈现典型的圆形或椭圆形杯口状结构,直径40~100 nm; DDP-EXO表达外泌体标志蛋白CD63、TSG101、CD9;用PKH67标记DDP-EXO显示,DDP-EXO可以被敏感细胞MDA-MB-231摄取;敏感细胞株MDA-MB-231与DDP-EXO共培养48 h后,DDP的IC50升高2.24倍,差异有统计学意义(P<0.01); MDA-MB-231细胞与DDP-EXO共培养,再予益气小复方干预后DDP IC50明显降低(P<0.01)。结论:三阴性乳腺癌外泌体可能具有传递耐药信息的作用,耐药细胞外泌体能够使敏感细胞获得一定耐药性,益气小复方可一定程度上阻滞外泌体传递耐药性。

基于NF-κB通路评价益气小复方对三阴性乳腺癌顺铂耐药的逆转作用

目的:探讨益气小复方(Yiqi Formula)逆转三阴性乳腺癌顺铂(platinum,DDP)耐药细胞株MDA-MB-231/DDP耐药的能力及其潜在的机制。方法:采用MMT检测协同效应浓度下的益气小复方对DDP诱导三阴性乳腺癌DDP耐药细胞株MDA-MB-231/DDP生长抑制的影响,随后采用流式细胞仪检测益气小复方联合DDP对MDA-MB-231/DDP诱导凋亡的增敏作用;应用电感耦合质谱仪检测比较益气小复方联合DDP组与单用DDP组MDA-MB-231/DDP胞内铂离子浓度累积的差异,并采用Western Blot检测益气小复方对耐药相关蛋白以及对NF-κB通路的调控作用。同时,建立乳腺癌移植瘤模型,分为对照组、DDP组、益气小复方组和益气小复方联合DDP组以做进一步验证。结果:益气小复方联合DDP可使MDA-MB-231/DDP耐药指数显著降低(P<0.01),且MDA-MB-231/DDP在不同浓度DDP作用下联合作用组均比单用DDP组凋亡比例显著增加(P<0.05或P<0.01);益气小复方联合DDP可显著增加MDA-MB-231/DDP细胞株胞内铂浓度(P<0.01);联合组中P糖蛋白(P-gp)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)和多药耐药相关蛋白2(MRP2)的表达量分别是DDP组的41%、36%、47%(均P<0.001);益气小复方联合DDP组中IKKα蛋白表达和NF-κB蛋白核内积累水平均较其他组显著降低(均P<0.01)。体内实验结果提示,益气小复方联合DDP组较其他组瘤体体积增加较慢(P<0.05)、剥瘤前通过荧光活体成像荧光值低(P<0.05)以及最终瘤体的质量小(P<0.05)。结论:益气小复方可能通过抑制了NF-κB通路的活性,进而下调相关转运蛋白超家族成员P-gp、BCRP和MRP2的表达从而逆转MDA-MB-231/DDP细胞对DDP的耐药作用。

三阴性乳腺癌耐药细胞模型的构建及其生物学特性考察

目的建立人三阴性乳腺癌细胞耐药模型MDA-MB-231/DOX,并考察其生物学特性。方法以人三阴性乳腺癌细胞为亲本细胞,采用低浓度持续加量诱导法建立耐受盐酸多柔比星的细胞株MDA-MB-231/DOX。在显微镜下观察细胞形态学的变化;利用细胞毒性实验检测化疗药物对细胞的半数抑制浓度(IC_(50))和细胞的耐药指数(RI),并绘制细胞生长曲线;通过流式细胞术检测细胞周期变化;采用Western blot法检测细胞中P糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白(MRP2)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)、葡萄糖转运蛋白(GLUT1、GLUT3)的表达;通过检测细胞中丙酮酸、乳酸、三磷酸腺苷(ATP)浓度考察MDA-MB-231/DOX细胞在能量代谢方面的生物学特性。结果所构建的能够耐受不同浓度盐酸多柔比星的MDA-MB-231/DOX细胞,其耐药指数在61~189范围内,对紫杉醇、顺铂和10-羟基喜树碱的耐药指数分别为1585.12、29.67、2.01;耐药细胞MDA-MB-231/DOX中P-gp、MRP2的蛋白表达水平明显高于亲本细胞MDA-MB-231,丙酮酸浓度、乳酸浓度、ATP浓度、GLUT1表达均高于亲本细胞MDA-MB-231。结论成功构建了人三阴性乳腺癌耐药细胞株MDA-MB-231/DOX,具有多药耐药性,其生物学特性与亲本细胞存在一定差异,为乳腺癌体外模型及其耐药机制的研究提供实验基础。