利用体外胃蛋白酶-胰酶-盲肠液法评价驴不同粗饲料组合的营养物质降解率与组合效应

本试验利用体外三步法(胃蛋白酶-胰酶-盲肠液法),比较研究不同粗饲料组合的营养物质体外胃-小肠-盲肠降解率(GICD)与胃-小肠的体外降解贡献率;并以经胃与小肠降解后的残渣为底物研究其盲肠体外发酵参数,探究主要粗饲料的组合效应,为驴生产中粗饲料资源的科学搭配和利用效率的提高提供依据。试验选择成年健康德州驴作为盲肠液供体进行体外培养,采用单因素完全随机试验设计,分为4组,每组6个重复。将谷草与玉米秸秆的混合草(谷草∶玉米秸秆=6∶4)作为对照组(CON组),其余3组分别利用苜蓿草、全株玉米青贮和羊草等比例替代CON组中20%的谷草和玉米秸秆混合草,依次为Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组。结果表明:与CON组相比,Ⅱ组干物质(DM)和有机物(OM)的GICD与消化能(DE)及Ⅰ组粗蛋白质(CP)的GICD显著升高(P<0.05);Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组中性洗涤纤维的GICD及Ⅰ组和Ⅲ组酸性洗涤纤维的GICD显著升高(P<0.05),各组间半纤维素的GICD差异不显著(P>0.05)。Ⅰ组和Ⅱ组的DM和OM在胃-小肠(盲肠前)的体外降解贡献率及Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组的CP体外降解贡献率显著高于CON组(P<0.05)。体外盲肠发酵结果表明,各组间pH与氨态氮浓度的差异均不显著(P>0.05),CON组的菌体蛋白(P=0.091)与总挥发性脂肪酸浓度(P=0.075)有低于其他组的趋势。在3、24和48 h,CON组的产气量均有低于其他3组的趋势(P=0.061,P=0.096,P=0.080);在其余时间点,各组间产气量差异均不显著(P>0.05)。多项组合效应值(MFAEI)从高到低依次为Ⅱ组、Ⅰ组、Ⅲ组和CON组。综上可知,将苜蓿草、全株玉米青贮和羊草分别替代20%的谷草和玉米秸秆混合草,均产生正组合效应,提高了营养物质降解率和盲肠发酵功能,尤以苜蓿草和全株玉米青贮替代组的组合效应较好。

Optima of Trypsin-Catalyzed Hydrolysis and Its Inhibition Determined by SDS-PAGE

SDS-PAGE was applied to determine trypsin activity and inhibition. After the hydrolysis by trypsin to substrate bovine serum albulnin (BSA) under different temperatures and pH, the hydrolysis degree of BSA was conducted using SDS-PAGE. From the quantitative analysis to the electrophoresis bands of BSA and its hydrolysis products in SDS-PAGE pattern, the change of trypsin activity was determined, and then the optimum temperature at 40°C and the optimum pH at pH 8.5 - 8.7 for trypsin activity were obtained. All the target bonds in BSA molecule could be hydrolyzed at the same time by trypsin. The inhibition was due to the binding of inhibitor to trypsin, which made it impossible for trypsin to touch the substrate protein. SDS-PAGE was demonstrated to be also an effect method for assaying the characteristics of trypsin activity and its inhibition.

利用体外三步法研究驴粗饲料原料的体外营养物质降解率

试验采用体外三步法(胃蛋白酶-胰酶-盲肠液法)研究了6种常用驴粗饲料原料体外营养物质降解率。采用单因素完全随机试验设计,比较研究全株玉米青贮、玉米秸秆、谷草、苜蓿、燕麦草、羊草6种粗饲料的体外营养物质降解率,每种粗饲料作为一个处理,每个处理6个重复。饲料原料在模拟胃内环境消化1 h,模拟小肠内环境消化24 h,在体外盲肠环境连续培养48 h。结果显示,全株玉米青贮和苜蓿在驴胃-小肠体外干物质(DM)、有机质(OM)、粗蛋白(CP)营养物质降解率显著高于玉米秸秆、燕麦草、谷草和羊草(P<0.05)。全株玉米青贮和苜蓿在驴胃-小肠-盲肠体外DM、OM、中性洗涤纤维(NDF)、和半纤维素(HCL)降解率与消化能(DE)均显著高于其他4种粗饲料(P<0.05),苜蓿在驴胃-小肠-盲肠体外CP降解率最高,显著高于其他粗饲料(P<0.05),全株玉米青贮与燕麦草次之。研究表明,6种粗饲料中苜蓿和全株玉米青贮体外营养物质降解率较高,表明其营养价值高于谷草、玉米秸秆、燕麦草和羊草。

利用体外三步法研究驴主要精饲料原料的体外营养物质降解率

试验旨在通过体外三步法即胃蛋白酶-胰酶-盲肠液法,模拟体外胃肠道环境,对驴常用精饲料原料在胃肠道中的体外降解率进行研究,评定驴常用精饲料原料的营养价值。选取驴养殖生产中广泛应用的精饲料原料,其中能量饲料9种,蛋白质饲料8种。模拟胃内环境消化1 h、小肠内环境消化24 h,进入体外盲肠环境进行连续培养24 h,采集盲肠液,测量精饲料原料的体外降解率。结果表明,驴对能量饲料的胃-小肠-盲肠体外降解率中,玉米、压片玉米和小麦营养价值较高,玉米皮和大豆皮较低,小麦麸、玉米胚芽粕、次粉和喷浆玉米皮居中。蛋白质饲料在驴的胃-小肠-盲肠体外降解率中,玉米蛋白粉、豆粕、DDGS、膨化大豆和双低菜粕的营养价值较高,尤以玉米蛋白粉最高,菜粕与棉粕的营养价值较低,全棉籽最低。能量饲料和蛋白质饲料的干物质(DM)、有机物(OM)与粗蛋白(CP)在胃-小肠(盲肠前)营养物质贡献率大多数在70%以上。但玉米蛋白粉、玉米皮和大豆皮的DM、OM较低,而玉米蛋白粉的CP也较低,为39.4%。研究表明,能量饲料中以玉米、压片玉米和小麦的营养物质体外降解率与消化能(DE)较高,玉米皮与大豆皮较低,其他能量饲料居中。蛋白质饲料中以豆粕、DDGS、膨化大豆和双低菜粕的营养物质体外降解率与DE较高,尤以豆粕最高。

酶消化法培养Balb/c胎鼠下颌突未分化外胚间充质细胞

目的 :用酶消化法培养Balb/c胎鼠下颌突外胚间充质细胞 ,并与组织块法相比较 ,研究其形态和生长特性。方法 :采用 1.2 5 g/L的胰酶消化法获取E 12 .5dBalb/c胎鼠下颌突外胚间充质细胞 ,用含 10 6U/LLIF的D/F12 培养细胞 ,倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况 ,免疫组化鉴定细胞来源及分化状况。结果 :培养的细胞呈单层生长 ,长梭形 ,有 2～ 4个突起 ,抗HNK - 1、Vimentin、S - 10 0、NSE染色阳性 ,抗GFAP、NF、MA染色阴性 ,证实为未分化外胚间充质细胞。结论 :用酶消化法可在短期内获得大量的未分化外胚间充质细胞。

胰蛋白酶消化法和组织块法原代培养人包皮成纤维细胞的比较

小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)是目前国际上公认的人胚胎干细胞(hESCs)体外培养的饲养层细胞,但MEFs存在寿命短、动物源性污染等问题,需要探索适于hESCs体外培养且寿命长的人源性饲养层.采用胰蛋白酶消化法和组织块法分别原代培养人包皮成纤维细胞(hFFs),探索hFFs原代培养的最佳方法,为hFFs作为饲养层在hESCs研究中的应用提供可靠的科学依据;通过倒置显微镜下观察其生长状态和免疫细胞化学染色鉴定,结果显示两种原代培养方法获得的hFFs的形态及生物学特性均符合成纤维细胞;通过测定细胞生长曲线及MTT法检测,结果显示两种原代培养方法获得的不同代数的hFFs均具有较高的增殖活性,传代10余代仍能保持较好的细胞形态,可以制备成饲养层用于hESCs的研究.

胃蛋白酶-胰蛋白酶两步体外消化法评定豆粕粉碎粒度

选用1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mm筛孔孔径的筛片粉碎得到粒度为432、505、637、717、805μm的豆粕,然后制成粉状配合饲料和颗粒饲料。对豆粕及不同粒度基础配制的粉状配合饲料和颗粒料分别进行胃蛋白酶-胰酶体外模拟酶解法测定消化率。试验结果表明:随着筛片孔径从1.0 mm扩大到3.0 mm,豆粕粉碎样品的粒度也从432μm增大到805μm,筛孔孔径与粒度间具有线性关系(P<0.01);选用浓度为70mg/mL胃蛋白酶和16 mg/mL胰蛋白酶进行体外模拟消化,随豆粕粒度的增加,豆粕、粉状配合饲料、颗粒料体外干物质(DM)、粗蛋白质(CP)消化率均随豆粕粉碎粒度的增加均呈现降低。豆粕和颗粒料的体外消化率随豆粕粉碎粒度减小呈线性提高(P<0.01),但粉状配合饲料消化率随豆粕粉碎粒度的变化未出现明显的线性规律(P=0.443、P=0.113)。505μm组和637μm组均可得到较高的消化率,但考虑到加工成本问题,637μm可作为豆粕在仔鸡颗粒料最适粉碎粒度,即2.0 mm为制作仔鸡颗粒料的粉碎机筛片最佳筛孔孔径。

大豆胰蛋白酶抑制因子的危害及其检测研究进展

大豆胰蛋白酶抑制因子是大豆中一类主要的抗营养因子,其主要危害表现在致使胰腺增生、肿大以及抑制动物生长等方面。近年来,针对大豆胰蛋白酶抑制因子的检测方法已成为研究热点。文章通过对大豆胰蛋白酶抑制因子的危害和现有的检测方法进行综述,旨在为大豆及其制品中胰蛋白酶抑制因子的监控以及建立大豆胰蛋白酶抑制因子快速、高效的检测方法提供参考。

大豆中胰蛋白酶抑制剂的钝化方法研究

[目的]对大豆中胰蛋白酶抑制剂进行钝化处理,降低其活性,提高大豆饲料的营养价值。[方法]采用正交试验设计对大豆中胰蛋白酶抑制剂的化学钝化法(亚硫酸钠法)和物理钝化法(微波法和超声波法)进行比较,确定最优钝化工艺条件。[结果]大豆中胰蛋白酶抑制剂的化学法钝化最优工艺条件为:Na2SO3浓度为0.03 mol/L,温度75℃,钝化时间60 min;物理微波法钝化最优工艺条件为:微波功率240 W,时间90 s,粉碎度为过60目筛;物理超声波钝化法最优工艺条件为:加水量30 ml,时间30 min,粉碎度为过60目筛。[结论]3种钝化方法处理后,大豆中胰蛋白酶抑制剂活性均明显降低。

大豆胰蛋白酶抑制剂的制备及性质

采用硫酸钠盐析法从大豆乳清废水中选择性回收大豆胰蛋白酶抑制剂(soybean trypsin inhibitor,STI),且以商品化的Kunitz型胰蛋白酶抑制剂(soybean Kunitz trypsin inhibitor,KTI)为对照表征STI的理化性质和界面性质。结果表明,STI提取优化条件为:乳清溶液固形物含量13%、pH 4、加盐量9 g/100 m L,此条件下STI的得率为20.54%;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱显示,其主要成分为KTI,以苯甲酰-DL-精氨酸-p-硝基酰替苯胺盐酸盐为底物的胰蛋白酶抑制活力为2 135.00 TIU/mg,且具有良好的温度和pH值稳定性(80℃加热30 min后仍保持73.19%的抑制活力,在pH 2~11范围内抑制活力无明显变化);傅里叶变换红外光谱和圆二色性结果显示,其与KTI(Sigma T9218)的结构类似,二级结构主要是β-折叠和无规卷曲;界面性质数据表明,STI分子能很快吸附到气水界面形成高弹性界面,从而使其具有良好的起泡性和泡沫稳定性。因此,简单的硫酸钠盐析法是大规模制备高纯度且功能性质良好的STI的有效方法,所获得的STI在医药及功能性食品领域有潜在的应用价值。

胎鼠脊髓神经干细胞分离方法的比较

目的:比较机械法和胰酶消化法对胎鼠脊髓源神经干细胞增殖分化的影响。方法:分别用机械法和胰酶消化法分离胎鼠脊髓组织获得神经干细胞,应用台盼蓝检测细胞成活率,用无血清培养技术培养神经干细胞,应用MTT法检测细胞分裂增殖能力,采用免疫细胞化学法鉴定神经干细胞和分化细胞。结果:机械法获得的细胞数量多于胰酶消化法。细胞经过培养其增殖能力机械法略强于胰酶消化法,但无统计学意义。培养形成的细胞球Nestin阳性,诱导分化后可见NSE和GFAP阳性细胞。结论:运用机械法比胰酶消化法分离胎鼠脊髓组织获得神经干细胞方法简单,容易操作,经过培养细胞增殖能力较强。并可提供健康的细胞来源。

完整视网膜毛细血管网消化铺片技术及细胞计数方法的改进

背景 以往视网膜血管消化铺片法仅能够获得部分视网膜血管,无法客观评价全视网膜血管的病理改变,因此进一步获得完整的视网膜血管网是相关疾病实验研究和临床研究的基础. 目的 在国外对全视网膜血管消化铺片技术的基础上进行改良,建立全视网膜血管的铺片方法. 方法 30只健康Wistar 大鼠随机数字表法分为模型组和对照组,模型组20只大鼠用溶于0.05 mmol/L柠檬酸缓冲液的质量分数1.25％链脲佐菌素（STZ）腹腔内注射法制作糖尿病模型,对照组10只大鼠以同样的方法注射等容量柠檬酸缓冲液.注射后8个月经左心室注射PBS 100 ml,剪开右心房使血液及PBS流出后注射质量分数4％多聚甲醛100 ml,摘除眼球,将完整剥离的大鼠视网膜先进行胰蛋白酶消化,然后剥离玻璃体及内界膜,去除视网膜神经组织,得到完整的视网膜毛细血管网,平铺于载玻片上,将视网膜毛细血管网以视盘为中心划为内、中、外3个区域,采用盲法在光学显微镜下判定和计数中间区域影周细胞及无细胞血管. 结果 视网膜铺片显示,大鼠的视网膜血管为全血管型,可见放射状的视网膜中央动脉与视网膜中央静脉主干及逐级分支结构、小动脉与小静脉之间表浅层和深层的毛细血管网.周细胞略突出于血管管壁,在其形成影周细胞时,原有的细胞核缺失.无细胞血管的管径为邻近毛细血管管径的20％以上,并且在整个血管上无细胞核和影周细胞.结论 全视网膜消化铺片技术能够提供实验所需的完整视网膜毛细血管网,配合细胞计数方法,能够较好地评价视网膜的形态改变,并为视网膜血管和管壁细胞的定量分析提供有利条件.

生物法失活大豆胰蛋白酶抑制剂的研究

对生物法失活大豆腋蛋白酶抑制剂进行了研究。测定了豆制品中胰蛋白酶抑制剂的活性;比较了外源蛋白酶失活胰蛋白酶抑制剂的能力,确定了碱性蛋白酶失活胰蛋白酶抑制剂的最优条件为pH值8.88～9.05、温度43.40～44.70℃、酶用量10.44～11.29μL/g、底物浓度6.51%～7.18%。以发芽12h的大豆加工的熟豆乳中胰蛋白酶抑制剂活性降低了83.2%。保加利亚乳杆菌(Lb)、米黑毛霉(M.M)和米根霉(R.O)发酵能有效失活豆乳中的胰蛋白酶抑制剂活性。

3种小胶质细胞培养方法的比较

目的:建立一种小鼠小胶质细胞的简便高产量的原代培养方法。方法:在常规的神经胶质混合培养后,分别采用MeCarthy-Gulian法、营养丧失法、营养丧失+温和消化法三种方法进行小胶质细胞的分离纯化,通过细胞计数来了解比较培养细胞的产量,针对细胞表面的小胶质细胞的标志性抗原MAC-1进行免疫组织化学染色,观察细胞形态和激活状态,计算培养细胞纯度。结果:营养丧失十温和消化法细胞产量最高,三种方法的细胞培养形态、激活状态、纯度没有显著差异。结论:营养丧失和胰酶-EDTA温和消化均较经典的McCarthy-Gulian法产量高,2种方法结合起来的营养丧失+温和消化法是一种新的简便易行高产量的小胶质细胞培养方法。

酶法辅助鸭肝卵磷脂提取的工艺研究

本文以鸭肝为实验原料,用胰蛋白酶强化提取鸭肝中的卵磷脂。通过控制酶用量、酶反应时间、和酶反应温度来进行单因素实验,并以卵磷脂提取率为依据,对酶法强化鸭肝卵磷脂的提取工艺进行响应面优化。结果显示,响应面优化得到酶法强化鸭肝卵磷脂提取的最佳参数为:酶反应温度45.5℃,酶反应时间2.22 h,酶用量3090 U,鸭肝卵磷脂提取率可高达87.51%。验证试验得到鸭肝卵磷脂提取率为87.42%。验证实验显示,在该工艺条件下鸭肝卵磷脂的提取率达到较好值,可以作为工业化生产的基本加工条件。

诱导法羊毛胰酶减量加工方法研究

本文通过向羊毛鳞片部位引入碱性基团——氨基使其增加胰蛋白酶反应位点的途径，探讨了激活羊毛底物与胰蛋白酶的反应能力以求提高减量率的方法．

采用EDTA-胰酶处理难消化细胞株在凋亡检测分析中的可行性

目的研究细胞胰酶消化液中有无EDTA对流式细胞术检测细胞凋亡率的影响。方法以7种难消化细胞株作为实验对象,分为对照组和H2O2组(加H2O2促凋亡)。采用不同方法(不含EDTA的0.25%胰酶、含EDTA的0.25%胰酶、含EDTA的0.25%胰酶消化离心弃上清之后用1×PBS洗1次)对细胞进行消化处理,利用Annexin V-FITC荧光抗体标记细胞,流式细胞术检测细胞凋亡率。计算相同消化细胞条件下两组细胞的凋亡率差值。结果统计学分析结果显示:7种细胞株在3种消化细胞条件下的细胞凋亡率差值比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论胰酶中含EDTA对流式细胞术检测细胞凋亡无显著影响;因此可以利用EDTA抗凝集这一特性,将其加入胰酶消化液中,用于某些难消化细胞株凋亡样品的制备。

不同浓度补肾健脾方对卵巢颗粒细胞增殖作用的影响

目的:观察不同浓度补肾健脾方含药血清对原代培养的卵巢颗粒细胞增殖作用的影响以及不同浓度补肾健脾方对小鼠卵巢组织卵泡颗粒细胞层增殖的影响。方法:采用机械分离法结合胰蛋白酶消化法体外原代培养大鼠卵巢颗粒细胞,通过HE染色法进行细胞形态鉴定。采用MTT法检测,分别观察含质量分数5%、10%、20%补肾健脾方含药血清对卵巢颗粒细胞增殖作用的影响。体内实验通过给雌性小鼠灌胃不同浓度的补肾健脾方,连续灌胃4周,取卵巢组织做病理形态学观察。结果:质量分数20%、10%、5%的补肾健脾方含药血清对大鼠卵巢颗粒细胞增殖作用各不相同,质量分数20%、10%的含药血清、20%的空白血清对卵巢颗粒细胞的增殖作用最明显,与正常组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。补肾健脾方大剂量、中剂量、小剂量对卵巢卵泡颗粒细胞层的厚度呈现一定的增高趋势。结论:补肾健脾方对小鼠的卵巢颗粒细胞具有一定的增殖作用。

比较四种消化方法对神经干细胞传代增殖及活性的影响

目的:观察4种消化方法对体外培养的神经干细胞(N SC s)增殖及活性的影响。方法:原代培养新生大鼠海马N SC s,采用机械消化、0.25%单纯胰酶、0.25%胰酶+0.02%EDTA和0.02%EDTA 4种不同消化方法对N SC s球进行传代培养,经四唑盐比色法(M TT法)法检测不同方法对N SC s活性及增殖能力的变化。结果:与机械消化相比,0.25%单纯胰酶组,0.25%胰酶+EDTA组消化后的大鼠海马N SC s球长时间不聚集,细胞增殖停顿,而单纯EDTA组则明显提高了N SC s的增殖及活性,其余各组差异无统计学意义。结论:随培养时间延长,单纯0.02%EDTA组能够显著提高体外培养的大鼠海马N SC s的增殖水平及活力,且对细胞的后续损伤相对较小。

不同的抗原修复方法在免疫组化染色中的应用

目的研究分析免疫组化染色使用不同抗原修复的使用情况。方法选取66例我院乳腺癌手术切除组织来进行分析,采取不处理、电炉煮沸、高压、胰酶法等抗原修复方式进行免疫组化染色,探讨免疫组化染色在不同方式下的情况。结果抗原修复选择的方法不同,组织抗原暴露就会有差异性,高压加热能够让掩盖以及交联变性的抗原暴露和修复,提升免疫组化结果的准确度,选择高压热修复方式获得阳性结果比较可靠。结论临床中根据情况来使用不同的抗原修复方式能够对免疫组化结果进行优化,对难以检测的细胞内液和细胞核提供较高的检出率,结果可靠性较高。