细菌介导重金属转化过程及金属组学研究方法

重金属污染依然是我国严重的环境问题之一。在重金属胁迫下,微生物可通过复杂的过程,对重金属进行转化,降低重金属的毒性,其中转化涉及的分子机制广受关注。目前,在上述机制相关研究中,对转化过程中重金属的衡量多局限于总量的测定,而对其赋存形态的研究不足,导致难以取得有效进展。对细菌介导重金属的转化过程及金属在其中的赋存形态进行综述,探讨了金属组学研究方法在其中的应用,重点针对重金属的颗粒态与蛋白质结合态进行分析、表征和鉴定,为微生物介导重金属的转化研究提供新视角。

PEG介导的广东虫草原生质体遗传转化体系建立及其应用

【目的】广东虫草是我国特有珍稀食药用菌,其营养成分丰富、活性功效显著,已获批新资源食品,产业化应用前景广阔。建立广东虫草原生质体制备及遗传转化方法,可为广东虫草新品种选育及基因功能研究提供参考依据。【方法】以广东虫草菌丝体为材料,采用单因素分析方法对原生质体制备过程中酶解组合、酶解时间、酶解温度、复苏培养基及抗性标记进行筛选。同时以潮霉素抗性标记质粒pCAMBIA1300为转化片段,采用单因素分析方法对PEG介导的原生质体转化过程中亚精胺浓度、PEG加入间隔时间、抗生素添加时间进行筛选。并以广东虫草中的锌指半胱氨酸转录因子CgPro1敲除片段为目的转化片段,对转化系统进行验证。【结果】广东虫草原生质体制备的最佳组合条件为:采用含有裂解酶+崩溃酶的混合酶体系(1∶1)对广东虫草的菌丝体进行酶解,且酶解温度28℃、酶解时间为5.5 h时原生质体得率最高;原生质体复苏过程中,TB3复苏培养基对广东虫草原生质体的复苏效果最好、其次为0.6mol/L KCl-PDA;PEG介导原生质体转化过程中,加入5 mmol/L亚精胺、PEG加入间隔时间10 min、原生质体复苏3 d后添加250μg/mL潮霉素抗性标记进行筛选,转化效率最高。此外,通过建立的转化系统获得3个CgPro1敲除突变株及3个杂合子,表型分析结果显示,该基因参与广东虫草子实体发育过程。【结论】建立了成熟的广东虫草原生质体制备及PEG介导的遗传转化体系,可为今后广东虫草基因功能、蛋白定位等遗传操作研究奠定良好基础,同时为广东虫草遗传育种提供重要应用参考。

农杆菌介导水稻遗传转化的影响因素及应用研究进展

在水稻遗传转化过程中,农杆菌介导转化法与其他方法相比优势较多,比如转入的外源DNA结构完整及表达比较稳定、操作简便、转化率高等,已被广泛应用于转基因技术中。本文对根癌农杆菌介导水稻遗传转化的原理、影响遗传转化的因素进行了综述,并探讨了农杆菌介导转化法的应用前景。

农杆菌介导棉花大规模高效转化体系的研究

对农杆菌介导法转化棉花技术体系进行了综合改进,突破基因型的限制,使多品种或基因型 10个以上 的我国主栽棉花品种 系 转化成功,其中中棉所24号发展成为快速模式化转化品种 转化周期5～7个月,转化率8.1% ,CCRI27、CCRI36等多个品种转化体系基本成熟.不同转化体系的愈伤组织诱导率为10%～40%,愈伤组织胚性愈伤诱导率达到10%～40%,转化率总体平均达到1.8%,并对大批量再生苗的鉴定予以程序化.实现棉花转基因规模化,达到年产转基因棉花植株2000～4000株以上的水平.

以农杆菌为介导花生遗传转化研究

应用花生丛生芽再生体系 ,以农杆菌为介导将含有几丁质酶和 β - 1,3-葡聚糖酶抗病基因的植物双价表达载体 pCGⅡ转入花生品种泉花 10号和金花 10 12 ,获得转基因植株 ,并已通过PCR和Southernblot鉴定。研究表明 ,侵染时间以 5～ 15min的效果较好 ,侵染时间过长不利于提高转化率 ;0～ 1d预培养对基因转化有利 ,预培养2d可使转化率下降。

甘蓝下胚轴的高效再生和农杆菌介导B.t.基因转化甘蓝

分别对取材时间和培养基组成进行研究，建立了甘蓝下胚轴外植体的高效再生系统，当选取6～7d苗龄的下胚轴，将其置于MSB＋BA2．5mg／L＋ZT1mg／L＋IBA0．1mg／L的芽分化培养基中，并于培养基中附加AgNO37．5mg／L时，最高的芽分化频率，“夏光甘蓝”母本“103”可达81．67％，父本“60天早椰菜”可达78．56％。在此基础上，我们对影响转化频率的不同因素，即：抑制农杆菌生长的抗生素种类及其浓度、预培养的有无及感染时的浓度、下胚轴外植体与农杆菌的感染时间和共培养时间、筛选时抗生素的加入时间进行了探讨。共获得100余株卡那霉素抗性植株，全部移栽成活，生长良好。对转基因植株总DNA进行Southernblotting分析，证明nptⅡ基因已整合到甘蓝植株细胞基因组中。

基因枪介导的西瓜遗传转化研究

为了建立基因枪介导的西瓜遗传转化系统 ,以西瓜顶芽为受体 ,p BI12 1为供体 ,采用正交试验设计 ,研究了基因枪的扩散腔类型、轰击次数、受体的预培养和高渗处理对转化率的影响 .经方差分析与差异显著性测验 ,预培养时间与轰击次数对转化率影响显著 ,而扩散腔类型和甘露醇处理质量浓度对转化率的影响不显著 .经组织化学检测 ,有 33.3%抗 Kan试管苗为

离子束介导大豆DNA转化小麦后代高蛋白株的RAPD标记分析

利用离子束介导法将大豆DNA导入小麦,经过连续4代田间筛选和蛋白含量测定,获得高蛋白变异株系.采用RAPD分析技术,用34条随机引物对供体大豆、受体小麦和3个高蛋白小麦变异株的基因组DNA进行扩增.有29个引物扩增出清晰稳定的条带,其中18个引物扩增出的条带有不同程度的差异.高蛋白小麦突变株与受体小麦(对照)相比出现了条带的增加、缺失、扩增带深浅等变化,也出现了与受体小麦不同而与供体大豆相同的扩增带.实验结果表明,外源大豆DNA导入受体小麦可以引起后代基因组DNA序列变化,扩大小麦遗传基础.

建立青菜(Brassica chinensis)农杆菌介导法基因转化体系

以青菜地方品种矮脚黄、苏州青的子叶、子叶柄、真叶为外植体，在改良ＭＳ培养基上离体培养获得再生植株。在不定芽诱导培养基中添加２～２０ｍｇ／ＬＡｇＮＯ３可显著提高子叶不定芽诱导频率；添加０．１ｍｇ／ＬＮＡＡ和１～２ｍｇ／ＬＣＰＰＵ既可提高不定芽诱导频率，又可获得较多数量的不定芽。用含ＣｐＴＩ基因和ＮＰＴＩＩ基因的农杆菌感染子叶，获得了具有卡那霉素抗性的再生植株。培养基中添加羧苄青霉素促进子叶再生不定芽，头孢霉素和卡那霉素则抑制子叶再生。卡那霉素敏感性测定结果表明，当培养基中含卡那霉素１０ｍｇ／Ｌ时。

根癌农杆菌介导真菌遗传转化的研究进展

根癌农杆菌介导的真菌遗传转化是近年来发展的一种新方法 ,与其它方法相比 ,该方法具有操作简便、转化效率高和易得到稳定转化子等特点。目前 ,在根癌农杆菌介导下已实现了多个属种真菌的遗传转化 ,显示出良好的应用前景。综述了根癌农杆菌介导真菌遗传转化的转化机理和T DNA在真菌细胞中的存在方式等方面的研究结果 ,并展望这一方法的应用前景。

根癌农杆菌介导苹果遗传转化研究进展

论述和分析了影响苹果高效离体再生的主要因素 ,包括试验材料苹果的基因型、外植体生理状态、培养基类型、植物激素、Ag NO3、前期暗培养、抗生素等内外因子 ,以及影响根癌农杆菌介导苹果遗传转化的主要因素 ,包括苹果基因型、外植体生理状态、菌株类型、菌液浓度、活化物质的应用、共培养、预培养、选择培养、培养基成分等内外因子。并对其研究现状。

农杆菌介导的马铃薯试管薯遗传转化体系的优化及反义class Ⅰ patatin基因的导入(英文)

用两个马铃薯栽培品种“鄂马铃薯 3号”和“甘农薯 2号”的试管薯为供体材料 ,建立了一种农杆菌介导的简单、快速和高效的遗传转化系统。在含有 75mg L卡那霉素的选择培养基上 ,2～ 3周可产生抗性芽 ,4～ 5周获得完整的转基因植株。筛选出了试管薯遗传转化的优化条件 ,特别是在再生培养基中加入 2mg L玉米素 ,两个品种的转化频率分别高达 4 5 .5 %和 4 3.9%。周期短 (4～ 5周 )、一步培养和转化频率高 ,使该转化体系能够广泛用于马铃薯转基因的研究。用含有反义classⅠpatatin基因的表达载体pBSAP转化两个品种 ,共获得 12 0株卡那霉素抗性植株。PCR、PCR Southern和Northern杂交分析证明 ,此反义基因已整合到马铃薯基因组中并在转基因植株中正常转录。反义基因的表达导致部分转基因植株的试管结薯株率和单株结薯数降低。结果表明 ,该classⅠpatatin基因可能参与了块茎形成的调控。

根癌农杆菌介导TA29-Barnase基因转化甘蓝型油菜的研究

经比较影响农杆菌介导Barnase嵌合基因转化甘蓝型油菜的各种因素后 ,建立了高效稳定的转基因实验体系。按该体系 ,甘蓝型油菜“湘油 15”子叶柄预培养 2 0h ,OD60 0 为 0 5农杆菌菌液感染后共培养 3d ,在MS +2mg·L-1AgNO3 +4 5mg·L-1BA +10mg·L-1Km +30 0mg·L-1Carb培养基上进行选择 ,转化率为 8 8% ,PCR检测和Southern杂交检测证明外源基因已整合了甘蓝型油菜基因组中。

原生质体法介导真菌遗传转化的研究进展

原生质体法介导真菌遗传转化体系是实现大规模随机、定点突变和菌种改良的方法之一,为研究真菌致病性和侵染机制奠定了基础。原生质体法构建转化体系的步骤包括原生质体的制备、转化与再生,其中关键是原生质体的制备,通常采用酶解法破除细胞壁获得原生质体,其获得率直接影响转化效率。转化通常借助于聚乙二醇(PEG)介导、电击或限制性内切酶法完成,其中PEG介导的原生质体转化法较传统,技术较成熟;电击法操作较简单;限制性内切酶(REMI)介导的整合转化,因其转化效率较高,可产生大量稳定的转化子,正被越来越多地应用于丝状真菌的遗传转化。

农杆菌介导籼稻明恢86高效稳定转化体系的建立

以籼稻恢复系明恢86为材料,探讨受体材料、愈伤代龄、预培养时间、筛选时间等因素对转化效率的影响,并建立了高效稳定的农杆菌介导籼稻转化体系。转化技术参数如下,水稻花后15 d幼胚诱导的胚性愈伤(2～6代),作为转化受体材料,经4 d预培养,农杆菌侵染30 min,共培养3 d后,在30 mg·L-1潮霉素筛选出抗性愈伤,抗性愈伤经50 mg·L-1潮霉素筛选10～15 d后立即分化,幼胚的胚性愈伤转化频率可达6.98％,并且能够周年转化。

低能离子束介导的遗传转化研究进展

低能离子束注入对细胞的刻蚀作用提供了外源遗传物质进入细胞的途径。离子束介导的遗传转化技术已在水稻、小麦、烟草、棉花等多种植物上取得成功。对离子束介导遗传转化的原理和最新进展进行了评述。

农杆菌介导的小麦遗传转化几个影响因素的研究

采用携带gus和 (或 )bar基因双元表达载体 (p330 1,pBTAaB)的 3个根癌农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens)菌株(AGL 1,EHA10 5和LBA4 4 0 4 )对普通小麦 (TriticumaestivumL .)冬性栽培品种农大 170和农大 14 6的幼胚及幼胚愈伤组织进行了遗传转化。结果表明 ,菌液浓度OD60 0 1.0和侵染时间 1h对外植体的生存和转化最为有利 ;侵染前对外植体进行高渗处理较明显地提高了抗性愈伤获得率 ;乙酰丁香酮 (AB)对小麦转化的作用随菌株和外植体的不同而异 ;菌株 /质粒组合、受体基因型及外植体的类型、年龄和生理状态对转化效率有很大的影响。条件优化后 ,得到大量具有PPT抗性的愈伤和一些抗性植株。抗性愈伤的GUS染色阳性率在 5 0 %～ 6 0 %之间 ,所检测的抗性苗呈GUS阳性。对 6株抗性苗的PCR和Southern检测初步证明 ,外源基因已经整合到其中 3株的基因组中。

农杆菌介导的油菜遗传转化研究进展

综述了农杆菌介导的油菜等芸薹属植物高效转化体系建立的影响因素,总结了基因工程在改良油 菜等芸薹属植物性状中的最新研究进展,评述了植物in Planta转化法在油菜中的应用。

农杆菌介导的小麦活体转化

将含有NptII基因表达载体的农杆菌滴入小麦小花中进行小麦活体转化 ,通过对幼胚和成熟种子进行卡那霉素抗性初步筛选 ,并通过PCR和Southern杂交进行分子水平鉴定。结果显示 ,在所试的 5个品种 (系 )中 ,获得转化植株效率为 2 .0 %～ 3 .2 % 。

低能离子束介导水稻遗传转化的研究

为研究影响低能离子束介导水稻遗传转化效率的各种因素 ,以粳稻 0 2 42 8、花培 94 鉴 0 9、籼稻明恢 63这 3个水稻品种为实验材料 ,分析了离子的种类、能量、剂量、剂量率等参数对遗传转化的影响 ,建立了有利于遗传转化的组织培养条件和筛选程序。分子生物学检测证明 ,外源GUS报告基因已经整合到水稻基因组中 ,3个水稻品种获得抗性愈伤组织的转化率分别为 1 1 %、1 1 4%和 7 1 % ,获得再生试管苗的转化率分别为 1 5 2 %、1 87%和 1 1 3 %。为应用离子束介导法进行其它对农杆菌不敏感的禾谷类作物转基因提供了方法学的参照 ,并为深入研究离子束与生物体相互作用机制打下了基础。