传染性胰坏死病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

以纯化的兔抗传染性胰坏死病病毒(IPNV)VP2重组蛋白多克隆抗体为包被抗体,抗IPNV VP2单克隆抗体为检测抗体建立了IPNV双抗体夹心ELISA方法。优化反应条件为:兔抗IPNV VP2重组蛋白多克隆抗体包被浓度为1.28μg/mL,抗IPNV VP2单克隆抗体的工作浓度为1.34μg/mL,酶标二抗稀释比例为1∶2 000,以P/N>2,且OD490 nm>0.101 494作为阳性判定标准。该方法的重复性变异系数均小于10%,与传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、病毒性出血败血症病毒(VHSV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、轮状病毒(HRV)无交叉反应。对41份虹鳟肝脏样品分别进行双抗体夹心ELISA和RT-PCR检测,结果双抗体夹心法与RT-PCR法检测符合率为97%,表明本实验建立的双抗体夹心ELISA检测方法检测IPNV具有较高的敏感性和特异性,可用于IPNV的病原学检测。

双抗体夹心ELISA法检测食品中出血性大肠杆菌O15

以灭活重组基因工程菌EHEC O157Δler/stx(p BR322::stx1/2B::eae)免疫新西兰大耳白兔获得的兔多抗作为捕获抗体,以针对出血性大肠杆菌O157主要毒力因子的特异性单抗2H9为检测抗体,建立双抗体夹心ELISA方法并绘制标准曲线用于食品中出血性大肠杆菌O157的定量分析。标准曲线线性方程为y=0.3479x-0.4121,R^2=0.9862。该ELISA的重复性变异系数小于5%,稳定性良好。应用该方法测得出血性大肠杆菌O157∶H7 EDL933的最小检出限为10~3cfu/m L。食品样品接种实验表明:牛肉或猪肉样品接种量为0.08 cfu/g,增菌8 h后可以检出阳性反应;蔬菜和牛奶样品接种量为0.12 cfu/g(m L),增菌10 h后可以检出阳性反应。

抗人血管性血友病因子前导肽单克隆抗体的制备和应用

目的:拟研制能特异性识别血浆中人血管性血友病因子前导肽(VWF propeptide,VWFpp)的单克隆抗体,并且通过获得的抗VWFpp的单克隆抗体利用双抗体夹心法建立快速而可靠的检测血浆中VWFpp抗原的方法。方法:使用真核表达的重组人VWFpp(D1、D2区)蛋白作为免疫原,以常规方法免疫BALB/c小鼠,获取融合细胞的生长克隆,经过筛选和鉴定后,挑选能特异性分泌VWFpp单克隆抗体的杂交瘤细胞株,然后应用ELISA双抗体夹心法构建VWFpp抗原检测试剂盒,用于人血浆VWFpp的测定,对收集的12例行骨髓移植的白血病患者血浆进行VWFpp抗原水平动态检测。结果:最终获得两株可持续传代并分泌VWFpp单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并分别命名为SZ175和SZ176。经ELISA和Western blot鉴定,抗体能特异性识别VWFpp而不能识别成熟的VWF(不含前导肽)。利用双抗体夹心ELISA的原理,将单克隆抗体SZ175和SZ176成功制备成检测VWFpp抗原的试剂盒,动态检测白血病患者骨髓移植前后血浆中的VWFpp水平,结果显示移植后较移植前血浆中VWFpp水平有明显上升。结论:本研究成功制备两株抗VWFpp单克隆抗体,并且建立了VWFpp抗原双抗体夹心检测试剂盒,为进一步研究VWFpp的生物学功能以及血管性血友病临床诊断分型和内皮损伤相关疾病的预后监测提供了有力的工具。

H因子结合蛋白抗原含量双抗夹心ELISA检测方法的优化与应用

目的优化双抗夹心-酶联免疫吸附法(double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay,DAS-ELISA)检测H因子结合蛋白(factor H-binding protein,fHBP)抗原含量的方法,并将其应用于重组B群脑膜炎球菌疫苗体外相对效力评价。方法筛选4种抗fHBP单克隆抗体(monoclonal antibodies,McAb)适宜的抗体组合,通过方阵滴定法确定适宜的捕获抗体和酶标检测抗体稀释倍数、包被液、包被条件和显色时间,对优化后方法的专属性、线性、检测限、精密度和准确度进行了验证,并利用该方法检测fHBP蛋白相关制品的抗原含量。结果确定了适宜的双抗体检测组合以及试验条件(以柠檬酸缓冲液,4℃孵育16 h),在以柠檬酸缓冲液包被捕获抗体5.0000μg/mL、检测抗体1∶2000稀释、显色时间15 min的条件下,A450 nm-fHBP浓度曲线相关系数(r)>0.98,平行孔CV<10%,检测限<0.0002μg/mL,精密度<15%,准确度(直接回收率)<20%。亚家族之间抗原检测无干扰。多批fHBP相关制品检测结果稳定,差异无统计学意义(P>0.05)。结论优化后的方法可用于fHBP抗原含量的检定。

抗重组人肿瘤坏死因子－α单克隆抗体的研制及其初步应用

应用淋巴细胞杂交瘤技术获得１０株抗重组人肿瘤坏死因子－α（ｒＨｕＴＮＦ－α）ＭｃＡｂ。７株ＭｃＡｂ为ＩｇＧ１，２株为ＩｇＧ２ａ，１株为ＩｇＧ２ａ。１０株ＭｃＡｂ与淋巴毒素（ＬＴ或ｒＨｕＴＮＦ－β）、ｒＨｕＩＬ－６和载体菌菌体蛋白均无交叉反应。其中７株ＭｃＡｂ具有中和活性，７株ＭｃＡｂ能识到天然的ＴＮＦ－α。Ｇ１１和Ｅ６ＭｃＡｂ应用ＡＢＣ法免疫组化染色肝病患者组织细胞片得到明确的阳性结果。用２株识别不同表位的ＭｃＡｂ建立了一步夹心ＥＬＩＳＡ法，检测ＴＮＦ－α的敏感性可达到１００ｐｇ／ｍｌ左右。

双抗夹心法酶联免疫吸附试验影响因素探析

目的探析双抗夹心法酶联免疫吸附试验中牛血清清蛋白封闭,吐温20及浓度,样品与检测抗体的加样方式及孵育温度对酶联免疫吸附试验检测结果的影响。方法双抗夹心法酶联免疫吸附试验检测人白细胞介素(IL)-1Ra细胞因子作为模型,检测封闭条件,吐温20及其不同浓度,样品与检测抗体分开孵育及共同孵育,酶联孵育温度对标准品浓度与OD值关系的影响。结果酶联免疫吸附试验不封闭、洗液吐温浓度为0.05%且孵育温度为37℃的R^2=0.995 7;BSA封闭的R^2=0.981 1;洗液中吐温浓度0.005%时R^2=0.991 5,0.5%时R^2=0.9868;样品和检测抗体一同孵育1h或2h的R^2分别为0.964 5和0.874 2;孵育温度为25℃的R^2=0.996 1。结论BSA封闭步骤对低浓度的样品检测灵敏度不强;样品和检测抗体及酶稀释液中必须含有吐温20且浓度在0.05%条件下最合适;样品和检测抗体共同孵育会影响对高浓度样品的检测;37℃和25℃的孵育温度条件下的酶联免疫吸附试验检测灵敏度没有差异,但25℃孵育可以降低OD值背景。

IHNV单克隆抗体的制备及其初步应用

传染性造血器官坏死（Infectious haematopoietic necrosis,IHN）是严重危害我国鲑、鳟鱼苗种业的一种病毒性疾病。主要感染虹鳟、硬头鳟等冷水鱼类,急性感染时累计死亡率可达95%以上[1,2],并可垂直传播给子代。IHN被世界动物卫生组织（OIE）列为必须申报的动物疫病,被我国列为二类动物疫病。该病最早流行于北美和欧洲一些国家,目前已经蔓延至我国辽宁、河北、

附子理中汤对非酒精性脂肪性肝炎大鼠内毒素及其受体的影响

目的:探究附子理中汤对非酒精性脂肪性肝炎大鼠内毒素及其受体的影响。方法:将75只SD雄性大鼠随机分为3组,分别为正常组,模型组,附子理中汤观察组。采用腹主动脉取血法,收集血液后离心取上清,通过双抗体夹心法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和鲎合成基质显色法检测内毒素表达水平;免疫组织化学法检测肝组织内CD14表达水平,并利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测Toll样受体-4(TLR-4)与TNF-αmRNA表达水平。结果:与正常组比较,模型组TNF-α水平显著提高,且在第12~24周内持续维持较高水平;附子理中汤观察组TNF-α水平较模型组显著降低,但仍高于正常组;正常组大鼠肝脏TNF-αmRNA未见其表达,模型组TLR4和TNF-αmRNA表达量均显著升高。与模型组比较,附子理中汤观察组TLR4和TNF-αmRNA显著低于模型组,但仍高于正常组TLR4和TNF-αmRNA表达;正常组只有少量细胞能够表达CD14。与正常组比较,模型组大鼠肝组织在第12~24周内,CD14表达的阳性细胞数持续升高,在24周时略有降低,而附子理中汤观察组CD14表达的阳性细胞数与模型组比较显著减少。结论:附子理中汤可降低非酒精性脂肪性肝炎大鼠内毒素及其受体表达。

肾综合征出血热患者血清及尿液中TNF与SIL－2R的动态研究

采用双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法，对３０例肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）患者９６份血清及９６份尿液中肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）及可溶性白细胞介素２受体（ＳＩＬ－２Ｒ）水平进行了动态检测。结果显示：ＨＦＲＳ患者各期尿液及血清ＴＮＦ与ＳＩＬ－２Ｒ水平均高于正常对照组（Ｐ＜０．０１），且与临床病程密切相关，尿液与血清变化水平有密切的正相关性（γ＝０．５７５２，Ｐ＜０．００１；γ＝０．５４２７，Ｐ＜０．０１），尿液中含量与尿蛋白含量呈正相关（γ＝０．３４２５，Ｐ＜０．０１；γ＝０．４４８５，Ｐ＜０．０１），血、尿中ＴＮＦ与血、尿中ＳＩＬ－２Ｒ的变化呈正相关（γ＝０．６４２５，Ｐ＜０．０１，γ＝０．６５９６，Ｐ＜０．０１）。提示：ＴＮＦ及ＳＩＬ－２Ｒ是参与ＨＦＲＳ发病机理的重要介质。

肿瘤坏死因子与慢活肝及肝炎后肝硬化的关系

本文采用双抗体央心 ELISA 法检测了26例慢活肝和肝炎后肝硬化患者血清肿瘤坏克因子。结果显示:慢活肝和肝炎后肝硬化患者血清肿瘤坏死因子水平均高于正常对照(P<0.05);而慢活肝与肝硬化两组之间肿瘤坏死因子水平无显著差异(P>0.05)。当肝细胞损伤明显、ALT 高于正常时,则肿瘤坏死因子水平显著高于正常人(P<0.01)。提示肿瘤坏死因子检测可反映慢性肝病活动程度。

人内皮唾液酸蛋白改良双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为建立肿瘤内皮标志物1(tumor endothelial marker 1,TEM 1)ELISA检测方法,依据TEM 1基因胞外区片段序列及原核表达载体pMAL-p5x多克隆位点设计引物,采用PCR技术从含TEM 1全长基因载体中扩增目的片段,将双酶切的目的基因和载体经胶回收连接后插入表达载体并经测序鉴定,在转入宿主菌后用IPTG诱导目的蛋白表达,用分离纯化后的目的蛋白分别免疫鼠和兔以制备多克隆抗体并用ELISA和流式细胞术对抗体进行鉴定,采用兔抗TEM1为捕获抗体、鼠抗TEM 1为检测抗体建立双抗体夹心ELISA检测方法,棋盘滴定法探索各抗体最佳工作浓度,倍比稀释TEM 1,检测建立方法的灵敏度。成功构建的重组表达质粒pMAL-p5x-hCD248,经纯化复性后获得目的蛋白,免疫后获得兔多抗抗体效价为1∶1 024 000、鼠多抗抗体1∶512 000,棋盘法确定捕获抗体、检测抗体及酶标抗体最佳浓度分别为1∶500、1∶16 000和1∶20 000,经检测证实该方法测定下限为18.31ng/mL;检测50例恶性肿瘤患者与50例健康人血清TEM 1含量,发现差异无统计学意义。

食蟹猴血浆中TNF-α单克隆抗体间接ELISA检测法的建立

目的：建立检测食蟹猴血浆中TNF-α单克隆抗体的间接ELISA检测方法。方法：利用包被抗原TNF-α及酶标抗体山羊抗人IgG-HRP构建TNF-α单克隆抗体的ELISA检测试剂盒,并进行方法学验证。结果：间接ELISA法检测抗TNF-α抗体的最低检出限为0.2 ng·mL-1;最低定量限为0.5 ng·mL-1;浓度0.5-200 ng·mL-1范围内线性良好。日内、日间回收率分别为85.5%-95.0%和85.3%-94.0%;日内、日间精密度分别为4.6%-15.0%和1.1%-8.0%。结论：本实验成功建立了TNF-α单克隆抗体的间接ELISA检测方法,可用于食蟹猴血浆中TNF-α单克隆抗体的含量测定。

肿瘤坏死因子α在不同类型淋巴瘤患者中的表达及其临床预后意义

目的 探讨肿瘤坏死因子α（TNF-α）在不同类型淋巴瘤患者中的表达及其临床预后意义.方法 以88例不同类型淋巴瘤患者和88名健康志愿者为研究对象,采用免疫组化和双抗体夹心酶联免疫吸附（ELISA）法测定其石蜡组织和血浆标本中TNF-α的表达水平,并结合患者Ann Ardor分期、血常规、骨髓象、红细胞沉降率（ESR）、铁蛋白的表达水平进行单因素及多因素COX回归分析.结果 88例患者中男50例,女38例,平均年龄54.3 （10～80）岁,其中霍奇金淋巴瘤（HL）11例,非霍奇金淋巴瘤（NHL）侵袭组56例,NHL惰性组21例.TNF-α在对照、HL 、NHL侵袭和NHL惰性组患者组织中的阳性率分别为0、72.72％、67.86％和57.14％,与对照组比较,差异有统计学意义（P值均＜0.05）,各组间比较,差异有统计学意义（P值＜0.05）;TNF-α在血浆中的表达水平分别为（30.17±16.02）、（43.12±15.28）、（40.73±16.65）、（53.18±20.47）ng/L,与对照组比较,差异有统计学意义（P值均＜0.05）,各组间比较,差异有统计学意义（P值＜0.05）.多因素分析结果显示Ann Ardor分期Ⅲ～Ⅳ期、骨髓象异常、ESR＞20 mm/1 h、TNF-α表达阳性是影响患者无病生存和总生存的独立危险因素（P值均＜0.05）.结论 TNF-α作为一个独立的影响因素,可能在淋巴瘤中扮演促进肿瘤发生和发展的角色,直接影响患者的临床治疗和生存预后.

SPP-1、GDF-15和CXCL-1在人小肝癌中表达的初步研究

目的:针对前期应用基因芯片(Affymetrix Rat Genome 230.2.0)筛选出的大鼠早期肝癌中高表达的人同源分泌蛋白基因SPP-1、GDF-15和CXCL-1,定量验证其在人小肝癌中mRNA和血清蛋白的表达水平,并探讨其临床应用价值。方法:应用实时定量PCR和双抗体夹心法ELISA,检测15例小肝癌及正常肝脏组织(癌旁正常肝脏组织)的mRNA水平及对应小肝癌血清和正常人血清中的蛋白表达水平。结果:①SPP-1、GDF-15和CXCL-1基因在小肝癌组织中较对照组表达显著上调,其差异有统计学意义(P<0.05);②SPP-1血清蛋白检测值与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);GDF-15血清蛋白含量在小肝癌组中表达水平明显高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05);小肝癌组中CXCL-1血清蛋白含量较正常对照组表达下调,其差异有统计学意义(P<0.05)。结论:①NF-κB信号通路基因(CXCL-1)、P53信号通路基因(GDF-15)和SPP-1基因在人小肝癌组织中高表达,可能与肝癌发生的早期过程相关;②分泌性蛋白GDF-15和CXCL-1显示出小肝癌筛选诊断的潜在价值。