香蕉细菌性软腐病菌tus基因对细菌生物被膜形成的影响

为解析硫转运蛋白(tRNA 2-thiouridine synthesizing protein,tus)基因对香蕉细菌性软腐病病原细菌——玉米迪基氏菌Dickeya zeae生物被膜形成的影响,采用同源重组方法构建6株tus基因的缺失突变体及回补菌株,分析代表性突变体的转录组差异,并测定不同突变体的运动能力、细胞壁降解酶分泌水平以及对烟草的致敏性和对寄主的毒力,解析突变体生物被膜表型发生变异的原因。结果显示,玉米迪基氏菌的6株tus基因缺失突变体ΔtusA、ΔtusB、ΔtusC、ΔtusD、ΔtusE和ΔmnmA均表现出生物被膜表型缺陷;ΔtusC突变体转录组比较分析表明,细菌生物被膜形成和运动性相关基因均属于细胞进程中的显著下调表达基因,且前者主要为Ⅵ型分泌系统(type VI secretion system,T6SS)基因,进一步分析发现3个位点的T6SS基因均出现显著下调表达趋势;6株tus基因缺失突变体的运动能力显著减弱,但是细胞壁降解酶分泌水平和对烟草的致敏性并未发生显著变化;接种野生型菌株和基因回补菌株后香蕉的病情指数为42.5~67.5,而接种突变体后香蕉的病情指数下降至5.0~17.5,突变体的毒力下降。表明tus基因在玉米迪基氏菌生物被膜形成过程中具有重要功能。

黄瓜(Cucumis sativus L.)果瘤基因Tu的精细定位

黄瓜果实果瘤性状是非常重要的农艺性状,以黄瓜(Cucumis sativus L.)华北有瘤品系S52(P1)和欧洲无瘤品系S06(P2)为亲本,构建826株F2(S06×S52)群体为试验材料,对黄瓜果瘤基因Tu进行精细定位研究。田间调查和遗传分析发现F2群体的果实表现型为有果瘤与无果瘤,卡方值(χ2=0.583<3.84)检验表明其分离比符合3∶1,表明黄瓜果瘤性状是单基因控制的显性性状。早期研究中Tu基因被初步位于第5染色体的标记SSR16203和C_SC933之间,本研究利用公布的黄瓜基因组序列在这两标记之间设计了100对SSR引物,通过分析在两亲本的多态性,最后筛选得到4对SSR多态性标记。然后利用SSR16203和C_SC933标记和这4个多态性引物对826株F2群体进行进一步交换单株分析,最后将Tu基因定位于两翼标记SSR7和SSR18之间,剩余的交换单株分别为11株、16株,物理距离为263kb。经过FGENESH基因预测软件(http:∥www.softberry.com)分析,该区间仅含有候选基因31个。本研究为进一步果瘤基因Tu的最后克隆提供良好的研究基础。

牛支原体贵州株TU基因的克隆及序列分析

为了解牛支原体(M.bovis)贵州株GZ1、GZ2 TU基因的生物信息学特征,试验对牛支原体贵州株TU基因进行克隆测序和序列分析,应用DNAStar软件对TU基因推导氨基酸序列蛋白亲水性、表面可及性、骨架柔韧性及抗原指数进行预测和分析。结果表明:TU基因克隆测序基因片段长度为1009 bp,与预期相符。TU基因序列分析显示,牛支原体GZ1株与PG45标准株同源性为99.1%,与GZ2株同源性为99.0%。基因变异性显示,参考牛支原体标准株PG45,GZ1株在第55,134,191,257,389,512,674位发生了突变,在第178,951,962位发生了缺失,GZ2株仅在273位发生了突变。进化树分析显示,GZ1株与国内分离株属同一分支,进化关系近。GZ1株与GZ2、PG45株属不同分支,并且与国外的分离株进化关系较远。TU基因B细胞抗原表位预测结果显示,该蛋白亲水性、表面可及性、骨架区柔韧性都较好,抗原指数高,且分布相对均匀。该蛋白整体区域抗原优势明显,具有良好的抗原性。说明牛支原体TU基因相对保守,各地区分离株存在一定的进化关系。

基于TU基因的牛支原体感染病例实验室快速检测

牛支原体是一种主要引发牛呼吸系统症状为主的病原,鉴于其所致病例临床病变与我国已消灭疫病牛肺疫非常相似,该类疫病的快速鉴别诊断非常重要。实验针对贵州省疑似牛肺炎病例进行快速病原检测与目的基因序列分析,结果显示,从临床病例组织样本中扩增到大小约265 bp的TU基因目的片段,与预期结果相符;序列测定与分析显示,所扩增TU基因序列与牛支原体国内外分离株序列同源性高、亲缘关系近。实验结果表明,本次疫情为牛支原体感染所引起,为疫病防控提供了确切诊断信息。

基于牛支原体TU基因的Taqman探针实时荧光定量PCR方法的建立

本研究旨在建立牛支原体Taqman探针实时荧光定量PCR方法,便于临床上快速检测、诊断牛支原体病。本研究根据牛支原体TU基因(登录号:CP002188.1)设计合成特异性引物及Taqman探针,并通过试验检验所建立的检测方法的特异性和灵敏性。本研究建立的实时荧光定量PCR方法标准曲线的截距为46.20,斜率为-3.24,相关系数为-0.996,提示标准品的浓度与Ct值呈线性关系。方法性能评价显示,所建方法的组内及组间重复性变异系数均低于0.02,说明所建方法的重复性好;灵敏性试验中,目的基因最小检出浓度为19.1 copies/μL,敏感性是常规PCR(1.91×10^(4)copies/μL)的1 000倍。试验结果表明,本研究建立的牛支原体荧光定量PCR方法,具有精确、敏感、特异等优点,可为临床上快速检测牛支原体病提供技术支撑。