草鱼呼肠孤病毒vp5基因诱饵重组载体的构建、转化与自激活作用检测

根据草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)的vp5基因设计特异性引物,并扩增其开放阅读框序列(open reading frame,ORF),然后连接至pGBKT7载体上构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-vp5,转化至酵母菌Y2HGold,并进行PCR鉴定以及自激活性和毒性检测。PCR、酶切以及测序表明,pGBKT7-vp5重组诱饵载体构建成功。自激活性和毒性检测显示,阳性重组菌株pGBKT7-vp5/Y2HGold和阴性对照菌株pGBKT7/Y2HGold在SD/-Trp平板上出现大小相一致的乳白色菌落,且在SD/-Trp/X-α-Gel、SD/-Trp/AbA+/X-α-Gel平板上生长出蓝色菌落,而在SD/-Trp/-Ade/-His无菌落出现。表明重组菌株pGBKT7-vp5/Y2HGold表达的融合蛋白激活了报告基因AUR1-C和MEL1,没有激活报告基因ADE2和HIS3并且对宿主菌无毒性。该重组诱饵载体可用于酵母双杂交系统进一步筛选cDNA文库中与其相互作用的蛋白。

IBDV强、弱毒VP2诱饵载体构建及在酵母双杂交系统中自激活作用的检测

采用Gateway技术将鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)Gx株和Gt株vp2基因分别克隆到载体pDEST-32构建诱饵载体,通过酶切和PCR鉴定并测序正确后,用醋酸锂法转化酵母菌株MaV203,通过缺陷型平板筛选和X-gal颜色筛选检测诱饵载体有无自激活作用。结果表明,成功构建了诱饵载体pDEST-32-Gxvp2和pDEST-32-Gtvp2,并证明其在酵母双杂交系统中无自激活作用。为下一步利用酵母双杂交方法从鸡法氏囊B淋巴细胞和鸡胚成纤维细胞cDNA表达文库中筛选与强、弱毒VP2诱饵载体作用的分子奠定了基础。

HCV截短型E2蛋白在酵母双杂交系统中的表达及自激活作用检测

目的:获得不包含C末端跨膜区的HCV包膜糖蛋白E2蛋白(E2 661)编码基因,构建酵母双杂交诱饵载体,并检测对报告基因的激活作用。方法:PCR扩增HCV E2661 cDNA片段,先克隆入pMD-18T载体中,经测序正确后,再亚克隆入诱饵载体 pGBKT7,将重组质粒pGBKT7-E2661用醋酸锂法转化入酵母菌AH109,检测目的蛋白在酵母细胞中的表达以及对报告基因有无激活作用。结果:成功构建含有HCVE2661基因片段的酵母双杂交诱饵载体,目的片段可在酵母细胞AH109中正确表达,对酵母菌无毒性且对报告基因无自主激活作用。结论:可利用所构建的pGBKT7-E2661作为酵母双杂交系统中的"诱饵",进行相互作用分子的筛选研究。

西瓜食酸菌TA基因酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用的检测

【目的】构建西瓜食酸菌TA基因的酵母双杂交诱饵载体,为探究TA基因编码产物参与西瓜食酸菌致病的机制奠定基础。【方法】通过PCR扩增TA基因,并定向克隆到载体p GBKT7,获得可用于酵母双杂交的诱饵载体p GBKT7-TA,经酶切鉴定和测序验证为正确后将p GBKT7-TA转化到酵母菌株AH109中;进一步用ADE2、HIS3、Lac Z报告基因活性检测法检测p GBKT7-TA的自激活作用,用固体及液体营养缺陷型培养基培养法检测p GBKT7-TA的毒性作用。【结果】诱饵载体p GBKT7-TA对酵母菌株AH109没有自激活及毒性作用。【结论】所构建的诱饵载体可用于酵母双杂交系统的后续工作,为进一步从被西瓜食酸菌侵染的黄瓜子叶c DNA文库中筛选与TA互作的蛋白奠定了基础。

甘蔗条纹花叶病毒HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg基因酵母双杂交诱饵表达载体的构建及自激活检测

为探索甘蔗条纹花叶病毒与甘蔗的互作机制,利用酵母双杂交技术筛选与SCSMV互作的甘蔗因子基因,利用PCR技术克隆了SCSMV的HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg的编码区,构建到酵母双杂交诱饵载体p GBKT7上,获得了p GBKT7-HC-Pro、p GBKT7-P3N-PIPO、p GBKT7-CP和p GBKT7-VPg 4个诱饵载体。结果显示,将重组质粒转化酵母Y2HGold酵母菌株后,酵母菌株在SD/-Trp平板上生长良好,表明重组诱饵质粒表达产物对酵母细胞无毒性;在SD/-Trp/X-α-gal平板上长出白色菌落未变蓝,在SD/-Leu、SD/-Trp/-Ade、SD/-Trp/-His和SD/-Trp/X-α-gal/Ab A平板上不能生长,表明重组诱饵质粒表达产物对MEL1、ADE2、HIS3和AUR1-C报告基因无自激活作用。构建的诱饵表达载体可以作为诱饵用于文库筛选,为探索SCSMV侵染机制和发病机理奠定了基础。

人DOC-2氨基端PID结构域酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活鉴定

目的:获得人DOC-2氨基端磷酸酪氨酸作用结构域(PID)cDNA基因,构建酵母双杂交诱饵载体,并检测对报告基因的激活作用。方法:PCR扩增含人DOC-2编码区的全长cDNA片段,克隆入诱饵载体pGBKT7,再亚克隆得到含PID结构域的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-nDOC2。将重组质粒导入酵母菌AH109,检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用。结果:成功构建人DOC-2氨基端磷酸酪氨酸作用结构域(PID)酵母双杂交诱饵载体,该段基因表达的蛋白对酵母菌AH109既无毒性,对报告基因也没有激活作用。结论:我们可利用构建的酵母双杂交诱饵载体来钓取人DOC-2氨基端PID结构域的相互作用蛋白,以利于对DOC-2基因功能进行研究。

朊蛋白(prp105-125缺失)酵母双杂交诱饵载体的构建和鉴定

对小鼠朊蛋白(prp105-125缺失)的基因片段进行扩增,并将扩增片段导入诱饵载体pSos中构建酵母双杂交诱饵载体pSos-prp朊蛋白(prp105-125缺失),用重组质粒转化感受态酵母菌cdc25H,检验其表达产物在酵母细胞中有无毒性及自激活作用。序列分析结果表明,该试验成功构建了小鼠朊蛋白(prp105-125缺失)酵母双杂交诱饵载体,且该诱饵质粒的表达产物对酵母菌cdc25H既无毒性也无自激活作用。

NDRG家族成员酵母双杂交诱饵载体的构建,表达及自激活检测

目的:构建NDRG家族4个成员的酵母双杂交诱饵 载体,验证其在酵母中的表达并检测其自激活作用,为用酵母 双杂交方法寻找与NDRG家族相互作用的分子奠定实验基 础.方法:用PCR方法获得NDRG家族4个成员cDNA全长,将4个片段按正确读框插入酵母表达质粒PGBKT7中,经限 制性酶切鉴定正确后,PEG/LiAc法转化酵母菌株AH109, Western验证4个分子的正确表达,用表型筛选法及颜色筛选 法检测其自激活作用.结果:构建了NDRG家族4个成员的 酵母双杂交诱饵载体,并在酵母中正确表达,除NDRG4 B外 NDRG1,2,3均无自激活作用.结论:NDRG1,2,3可以用酵母 双杂交方法钓取与之相互作用的分子.NDRG4 B由于有自激 活作用不能用于酵母双杂交的筛选.

转录因子X-box结合蛋白1相互作用蛋白的筛选和鉴定(英文)

X-box 结合蛋白 1 是一种重要的转录因子,参与体内多项信号转导过程. 为进一步研究 XBP1 的生物学功能,运用酵母双杂交技术在肝细胞文库中筛选 XBP1 的结合蛋白. 首先运用 PCR 技术扩增获得 XBP1 的编码序列,克隆至 pGEM-T 载体,经测序鉴定后,亚克隆至诱饵载体 pGBKT7 中,转化酵母 AH109(a type). 免疫印迹检测诱饵质粒 pGBKT7-XBP1 在AH109 酵母中的表达之后,含有诱饵质粒的酵母 AH109 与含有肝细胞 cDNA 文库质粒 pACT2 的酵母 Y187(αtype)配合,配合后的二倍体酵母生长在含有 X-α-gal 的营养缺陷型培养基上 (SD/-Trp-Leu-His-Ade) 进行选择和筛选,经测序和序列比对确定阳性克隆的开放读码框 ORF,得到 7 种不同的蛋白质. 为了进一步验证这些筛选蛋白质与 XBP1 的相互作用,克隆其中一种蛋白质 MT1E,并运用 GST pulldown 和免疫共沉淀技术成功检测了 MT1E 和 XBP1 的相互作用(体外 / 体内),结果提示,MT1E 可能是 XBP1 的一个新的调节蛋白. 通过酵母双杂交技术筛选得到的 7 种蛋白质分别与肝细胞基础代谢、蛋白质的合成与运输、细胞的增殖与凋亡密切相关. 上述结果有助于揭示 XBP1 的生物学功能,为进一步探讨 XBP1 的表达和调控机制提供新线索.

酵母双杂交系统筛选HBV PreS1相互作用蛋白

目的利用Sos招募系统(SRS),构建含HBV PreS1基因的酵母双杂交诱饵载体,筛选人肝细胞与HBV PreS1蛋白相互作用的蛋白,进一步探讨HBV侵入肝细胞的机制。方法以HBV ayw亚型全长质粒PCP10为模板,PCR扩增HBV PreS1基因,克隆到酵母表达载体pSos中,构建诱饵质粒pSos-PreS1,将其转化cdc25酵母感受态细胞,提取酵母蛋白质进行Western blot分析,证实其在酵母细胞中的表达;将pSos-PreS1分别与pMyr Lamin C、pMyr SB共转化酵母,证实诱饵蛋白无自激活作用。将pSos-PreS1与人肝cDNA文库共转化cdc25酵母感受态细胞,通过营养及温度选择性培养筛选阳性菌落,扩增阳性菌落目的基因并测序。结果成功构建了HBV PreS1基因酵母双杂交诱饵载体pSos-PreS1,筛选得到5个准阳性克隆,序列分析表明其分别与人类钾通道调制因子1(KCMF1)、细胞色素C、VitD结合蛋白、人源去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)和人白蛋白具有高度同源性。结论利用SRS筛选出5个可能与HBV PreS1蛋白相互作用的蛋白,为进一步了解HBV侵入肝细胞的机制奠定了基础。

FXR2酵母双杂交饵载体的构建及酵母菌转化

目的构建FXR2酵母双杂交系统的“饵”质粒,并转化酵母菌,为筛选FXR2P互作蛋白作基础。方法提取pMD18-T-FXR2,酶切后将FXR2基因连接到MATCHMAKERLexATwo-HybridSystem中的plexA质粒上,得到“诱饵”(Bait)-plexA-FXR2,导入大肠杆菌扩增,筛选阳性克隆并提取重组Bait质粒,再转入酵母菌EGY48(p8op-lacZ)。结果通过遗传学方法筛选得到构建成功的plexA-FXR2;通过营养缺陷筛选,证明Bait重组质粒转入酵母菌中。结论成功构建Bait质粒并使酵母菌转化。

酵母双杂交诱饵蛋白LASS1融合表达质粒的构建及鉴定

目的构建酵母双杂交系统诱饵蛋白大鼠LASS1融合表达质粒,为进一步筛选大鼠脑神经元内与LASS1p相互作用的蛋白奠定基础。方法应用PCR方法获得大鼠LASS1基因2个片段,分别克隆入酵母双杂交系统诱饵蛋白质粒载体pGBKT7,转染酵母菌AH109并检测重组质粒的自激活现象及毒性。利用Western印迹检测重组质粒在AH109的表达情况。结果LASS1基因的PCR产物片段大小分别为Flag(111bp)、Slag(109bp);Western印迹结果表明2个重组质粒表达的蛋白均可以与抗c-Myc抗体在22kU处特异性反应;重组质粒转化酵母后无自激活作用。结论重组质粒pGBKT7-Flag、pGBKT7-Slag均能够在AH109内正确表达,可作为酵母双杂交系统诱饵蛋白使用。

LSPA1早期基因gp22细菌双杂交诱饵载体与筛选文库的建立

构建细菌双杂交系统中的诱饵载体p KT25-gp22和甲型副伤寒沙门氏菌基因文库以便后续的筛选实验。PCR扩增获得gp22基因,插入p KT25构成诱饵质粒p KT25-gp22。提取甲型副伤寒沙门氏菌基因组DNA,经Sau3AⅠ部分酶切后连接到p UT18C质粒的Bam HⅠ位点,获得基因组DNA表达文库。用化转的方法将诱饵质粒与p UT18C共转入BTH101,检测诱饵质粒自激活作用,并检测诱饵蛋白对宿主菌的毒性。将文库质粒电转至JM109感受态,PCR鉴定文库的多样性。诱饵载体p KT25-gp22无自激活报告基因的能力且对细菌的生长无毒性。所构建的副甲基因组文库覆盖基因组达8倍,满足文库筛选需要。成功构建细菌双杂交系统中诱饵载体p KT25-gp22,筛选文库质量良好,可应用于细菌双杂交实验。

盐藻酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活鉴定

构建用于杜氏盐藻核基质结合区结合蛋白(matrix attachment region binding protein,MBP)酵母双杂交试验的诱饵载体,进行自激活及毒性验证。以含有盐藻MBP质粒为模板,经PCR扩增后连接pMD18-T载体,经测序鉴定正确后,EcoRNde双酶切获得目的基因MBP,克隆入经同样双酶切的酵母载体pGBKT7,转化酵母菌株AH109及Y187,检测其自激活以及毒性。结果显示,成功扩增出盐藻MBP基因,重组质粒pGBKT7-MBP经酶切、测序表明序列正确,转化酵母菌株无自激活,无毒性。

同源重组快速构建甘蓝SCR酵母双杂交诱饵载体及其自激活作用的检测

采用巢式PCR获得甘蓝SCR的成熟肽编码区,利用同源重组技术首次将其克隆到pGBKT7载体中,构建酵母双杂交系统的诱饵载体pGBKT7-SCR,结果表明:通过巢式PCR获得了正确的甘蓝SCR成熟肽编码区,并成功构建到pGBKT7诱饵载体中,且转化有诱饵载体的Y2HGold在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,而在SD/-His-Trp和SD/-Trp/X-a-Gal/AbA营养缺陷平板上皆不能生长,说明对报告基因无自激活作用;且毒性实验也表明,SCR蛋白对酵母没有毒害作用.

猪瘟病毒酵母双杂交pGBKT7-NS3诱饵载体的构建与鉴定

利用RT-PCR技术扩增获得猪瘟病毒NS3基因片段,将其克隆至酵母双杂交系统诱饵载体pGBKT7中,经酶切,测序验证其正确插入后,将重组诱饵质粒转化酵母菌Y2HGold,检测其在酵母中毒性和自我激活作用,并利用Western blot分析诱饵载体在酵母中的转化情况。结果表明,pGBKT7-NS3诱饵载体在Y2HGold酵母细胞中可以表达,此载体在酵母细胞Y2HGold中无毒性和自我激活能力,研究结果为使用酵母双杂交技术筛选相互作用蛋白奠定了基础。

TTRAP酵母双杂交载体的构建

目的:肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)是一种具有广泛生物学效应的细胞因子,在机体炎症和免疫防御反应中起着重要作用,其中包括运动刺激所产生的机体反应。一种新型蛋白TTRAP被认为在TNF信号通路中有可能起重要作用,为揭示其作用以及寻找与其作用的互作蛋白,构建了TTRAP酵母双杂交系统的"诱饵"载体。方法:对含有人TTRAP全部序列的表达载体pGEX-4T-1-TTRAP进行PCR扩增,酶切后将TTRAP基因连接到酵母双杂交系统的pLexA质粒上,得到"诱饵"(Bait)-pLexA-TTRAP,导入大肠杆菌扩增,筛选得到阳性克隆并提取重组质粒。结果:测序结果表明克隆正确。结论:成功构建pLexA-TTRAP酵母双杂交载体,为寻找TTRAP的互作蛋白打下基础。

花生丛枝植原体免疫膜蛋白基因克隆及细菌双杂交诱饵质粒构建

初步分析植原体免疫膜蛋白的结构,以Imp构建诱饵质粒,为研究植原体与寄主互作的分子机理,探讨植原体传播、侵染及在寄主内的运输方式奠定基础。根据本实验室获得的花生丛枝植原体免疫膜蛋白基因序列设计特异性引物Imp-F/Imp-R,通过PCR扩增获得花生丛枝植原体免疫膜蛋白基因,大小519 bp,编码蛋白含有172个氨基酸残基,与SPWB膜蛋白的核苷酸差异一个碱基,氨基酸序列相同。另外与WBDL膜蛋白的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为79.8%和70.2%。对其进行系统发育树分析;初步分析imp基因编码蛋白的跨膜区和疏水区。分析结果表明:花生丛枝植原体免疫膜蛋白C端有一跨膜锚定区,N端主要为膜内亲水区,没有前导信号序列。预测花生丛枝植原体免疫膜蛋白是一类C端跨膜的植原体免疫膜蛋白。将imp基因克隆到带有λcI基因的pBT质粒上,构建诱饵载体pBT-Imp,并通过IPTG诱导表达,western blot检测和自激活检验对其进行检测。结果显示:所构建的诱饵载体pBT-Imp可用于细菌双杂交的进一步实验。

新城疫病毒HN蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

【目的】应用酵母双杂交技术构建新城疫病毒的血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白线性中和表位区的诱饵载体pGBKT7-HN-neu,为筛选靶向新城疫病毒HN蛋白的中和性纳米抗体奠定基础。【方法】合成HN蛋白的线性中和表位区HN-neu,将其克隆至酵母双杂交系统诱饵载体pGBKT7中,构建诱饵载体pGBKT7-HN-neu,经酶切鉴定和测序验证正确后,将pGBKT7-HN-neu转化酵母菌Y2H Gold,检测其在酵母细胞中的毒性和自激活作用。【结果】成功合成了HN-neu,构建的pGBKT7-HN-neu在酵母细胞Y2H Gold中无毒性和自激活能力。【结论】成功构建了诱饵载体pGBKT7-HN-neu。

SIGIRR胞内区酵母双杂交诱饵质粒的构建及自激活作用检测

目的：构建单免疫球蛋白白细胞介素-1受体相关蛋白（SIGIRR）胞内区酵母双杂交诱饵质粒，并检测其是否存在自激活作用。方法聚合酶链反应（PCR）扩增人SIGIRR胞内区基因片段（480～1230 bp），并将此基因片段重组入pSos载体中，构建诱饵质粒pSos-SIGIRR ，经酶切及测序鉴定构建正确后，将重组质粒与对照质粒共转化感受态酵母菌cdc25H ，接种于25℃SD/Glucose（-UL）和SD/Galactose（-UL）平板以及37℃ SD/Glucose（-UL）和SD/Galactose（-UL）平板上，连续观察6 d酵母菌生长状况；用Western blot法检测目的蛋白表达情况。结果正确构建了人SIGIRR胞内区酵母双杂交诱饵质粒pSos-SIGIRR ， pSos-SIGIRR在酵母双杂交系统中无自激活及毒性作用。Western blot结果显示，目的蛋白以170＆#215;103的融合蛋白形式表达。结论诱饵质粒pSos-SIGIRR可应用于酵母双杂交系统中，为在人肺互补脱氧核糖核酸（cDNA ）文库中寻找与SIGIRR相互作用蛋白奠定了重要基础。