禽病原性大肠杆菌1型菌毛的分离与鉴定

以旋涡混合法使禽病原性大肠杆菌分离株５６６ 、１７９４ 和ＴＫ３ 菌毛脱落，经硫酸铵沉淀、透析后进行蔗糖密度梯度离心，收集密度为１１０ 至１１５ｇ／ｃｍ３ 的蛋白带，经ＳＤＳＰＡＧＥ测定，３ 株菌菌毛蛋白的分子量分别在１７５ 、１７０ 和１７０ｋＤ；提纯菌毛保留了甘露糖敏感性凝集豚鼠红细胞的能力，证明它们为１ 型菌毛；从１７９４ 株提取的１ 型菌毛免疫ＢＡＬＢ／Ｃ 小鼠产生的高免血清在Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 中与３ 个菌株的相应菌毛蛋白均呈阳性反应。上述结果表明，受检的３ 株禽病原性大肠杆菌均表达了１ 型菌毛，其分子量在１７５ ～１７０ｋＤ 之间，３ 个菌株的１

禽病原性大肠杆菌1型菌毛主要亚单位结构基因的克隆、测序与表达

从禽源大肠杆菌037(O78)、166(O78)、120(O18)分离株和猪源大肠杆菌107/86分离株分别提取基因组DNA,并以此为聚合酶链反应(Polymerasechainreaction,PCR)的模板,扩增上述分离株的1型菌毛主要亚单位结构基因pilA,通过其编码的主要菌毛亚单位FimA蛋白氨基酸的序列比较发现:3个禽源株间FimA的同源性为94 3%至99 0%;禽源株和猪源株间FimA的同源性为89 6%至91 1%。通过对重组大肠杆菌的菌体裂解物的SDS PAGE电泳分析及Westernblot分析,禽源大肠杆菌O78037株、O18120株出现了一致的强反应,O78166株反应较弱,而猪源大肠杆菌107/86株反应最弱。这些结果表明:禽源大肠杆菌与猪源大肠杆菌1型菌毛间存在抗原多样性,这种多样性甚至出现在禽病原性大肠杆菌同一血清型的2个不同分离株之间,如O78037株O78166株之间,尽管其FimA氨基酸的同源性很高,为99 0%。

鸡大肠杆菌多价1型菌毛亚单位疫苗在鸡体内的免疫原性研究

用 1日龄雏鸡免疫评价了鸡大肠杆菌多价 1型菌毛油乳剂苗在鸡体内的免疫原性。用含 1型菌毛的 3个不同血清型 (O1、O78及O88)菌株 ,大容量培养后提取菌毛制备多价菌毛油乳剂苗。接种多价菌毛油乳剂苗的鸡用同源菌株攻毒后出现 10 %～ 11.2 %的死亡率 ,阳性对照组鸡攻毒后出现 70 %～ 80 %的死亡率 ;用异源菌株 (O36)攻毒后 ,免疫鸡出现 33.3%的死亡率 ,而未免疫阳性对照组鸡死亡率达 70 %。免疫鸡在气囊 ,心包及肝脏的病变非常轻微 。

鸡源大肠杆菌1型菌毛结构基因(pilA)克隆

根据人源大肠杆菌 1型菌毛结构基因 (pilA)DNA序列 ,在其保守区设计了 1对带有 BamHI/Hind Ⅲ酶切位点的引物 ,经PCR扩增 ,从 2 4株鸡源大肠杆菌致病株染色体中得到 2 1个大小约 6 5 7bp的阳性产物 ,经酶切、连接、转化及筛选 ,得到 3种来自不同血清型鸡源大肠杆菌 (O1、O78及O88)PCR产物的阳性克隆。经核酸序列测定 ,确认所克隆的外源基因为

3个血清型鸡源大肠杆菌1型菌毛蛋白抗原位点变异分析

采用Goldkey及DNA Star分析软件对发表的3个不同血清型的鸡大肠杆菌1型菌毛结构基因(pilA)进行同源性及抗原位点分析。结果显示,3种鸡大肠杆菌(O_1、O_(78)及O_(88))l型菌毛pilA基因相似性为91.36％～98.38％,所编码的氨基酸同源性为93.50％～97.84％;3种血清型鸡大肠杆菌(O_1、O_(78)及O_(88))1型菌毛蛋白二级结构在1～73位及150～185位氨基酸的二级结构基本相似,而111～150位氨基酸的α螺旋与β折叠的数量有所不同。菌毛蛋白亲水性、抗原性及抗原决定簇预测表明,来源于3种血清型大肠杆菌的1型菌毛蛋白在l～110位及150～184位氨基酸存在相似的二级结构及抗原位点,且不同血清型之间存在一定的共同抗原。

鸡源大肠杆菌1型菌毛菌株粘附鸡呼吸道上皮的电镜观察

用电子显微镜观察了鸡大肠杆菌 (O78) 1型菌毛在不同温度中的表达情况。细菌在营养肉汤中 37℃培养 4 8h可表达大量的菌毛 ,而 18℃培养 4 8h则缺乏菌毛。扫描电镜观察结果 ,37℃培养的鸡大肠杆菌可大量粘附鸡呼吸道上皮粘膜 ,而 18℃培养的同种菌则不能粘附 ,表明鸡大肠杆菌粘附鸡呼吸道上皮的过程由

鸡源致病性大肠杆菌1型菌毛pilA基因的PCR扩增、克隆及序列分析

研究选择从四川规模化鸡场分离鉴定的5株优势血清型鸡源致病性大肠杆菌代表株(O89,O119,O141,O127)的1型菌毛pilA基因的PCR扩增片段分别定向克隆到pUC18质粒的多克隆位点,并转化到DH5α株大肠杆菌载体菌中,对目的基因的序列测定结果表明:5个克隆片段均含有1型菌毛pilA基因的全序列,全长459bp,编码信号肽和结构蛋白。用生物软件(DNASTAR)对9株大肠杆菌1型菌毛pilA基因序列、氨基酸序列、菌毛蛋白质二级结构预测及抗原性进行了分析比较,结果显示:鸡源致病性大肠杆菌1型菌毛间具有同源性,1型菌毛间存在一定的相同抗原位点。

禽源和猪源大肠杆菌1型菌毛主要亚单位抗原多样性分子基础的初步研究

从禽源大肠杆菌037(O78)、166(O78)、120(O18)分离株和猪源大肠杆菌107/86分离株分别提取基因组DNA,并以此为聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)的模板,扩增上述分离株的1型菌毛主要亚单位结构基因pilA,得到了大小约570bp的扩增产物,将此扩增产物克隆于T载体,通过内切酶酶切分析得到4个阳性重组质粒;对上述4个大肠杆菌分离株的pilA基因进行序列测定,通过其编码的主要菌毛亚单位FimA蛋白氨基酸的序列比较发现:3个禽源株间FimA的同源性为94.3%至99.0%;禽源株和猪源株间FimA的同源性为89.6%至91.1%。在pilA开放性阅读框所编码的FimA182个氨基酸序列中,禽源大肠杆菌O78血清型的2个分离株037株和166株间只有2个氨基酸不同,其同源性为99.0%。

嗜水气单胞菌J-1株粘附素及其受体分析

以EPC细胞和HEp 2细胞为细胞模型 ,用嗜水气单胞菌 (Aeromonashydrophila ,Ah)J 1株进行粘附试验 ,同时以Ah4型菌毛的抗血清作粘附抑制试验 ,用以分析AhJ 1株的粘附素及其受体。EPC细胞粘附和粘附抑制试验证实 ,AhJ 1株粘附素受体具有甘露糖、胆固醇成分 ,有少量半乳糖成分 ,无葡萄糖成分。HEp 2细胞粘附和粘附抑制试验证实 ,与其它非菌毛粘附素如S层及外膜蛋白相比 ,Ah 4型菌毛的粘附作用较为显著。抗 4型菌毛抗体抑制细菌的粘附力达 80 %以上。抗S层、外膜蛋白抗体也能使细菌的粘附力下降 ,表明Ah的粘附作用由菌毛粘附素与非菌毛粘附素共同参与。

地高辛标记大肠杆菌1型菌毛结构基因核酸探针对鸡大肠杆菌分离株的检测

将PCR扩增的鸡大肠杆菌 1型菌毛蛋白结构基因 (pilA)用地高辛标记成核酸探针与分属 2 8个血清型的 50个鸡大肠杆菌分离株进行斑点杂交 ,阳性率达 84% ,用甘露糖敏感血凝试验 (MSHA)检测阳性率为 72 % ,表明核酸杂交比MSHA法更敏感。

鸡大肠杆菌1型菌毛fimH蛋白结构基因克隆及序列测定

根据已发表的大肠杆菌1型菌毛fimH基因序列,以产1型菌毛菌株MG2(O11)、YR5(O78)、MG12(O18)基因组DNA为模板,对大肠杆菌1型菌毛fimH基因进行扩增并与国外同源菌株基因序列进行比对。结果表明:核酸同源性分别为97.8%、99.7%、97.8%,氨基酸序列的相似性分别达到98.7%、99.3%、98.0%。运用DNA-STAR软件对fimH蛋白抗原决定簇进行预测分析,发现它们的抗原决定簇基本相似,这说明fimH基因序列及氨基酸序列的变异并未对fimH蛋白的抗原结构产生明显影响。

鸡大肠杆菌1型菌毛基因簇E基因的克隆与序列测定

鸡大肠杆菌1型菌毛是一种重要的致病因子,可以黏附到家禽机体的呼吸道上皮,从而引起机体发病。1型菌毛基因簇由fimB,fimE,fimA,fimI,fimC,fimD,fimF,fimG和fimH等组成。在国外K12株大肠杆菌1型菌毛fimE基因是一个大小为为555 bp,具有相变开关功能的片段,我国鸡源大肠杆菌1型菌毛fimE基因序列尚未见报道。本研究通过聚合酶链式反应扩增、克隆到了鸡大肠杆菌MG10株1型菌毛的fimE基因,测定了基因序列,并运用相关软件将其翻译成氨基酸序列。通过对fimE基因序列分析比较及对fimE蛋白进行预测分析,发现鸡大肠杆菌与K12大肠杆菌1型菌毛的fimE基因之间的同源性达到99.1%以上;亲水性、抗原性预测表明,二者之间都存在密切的相似相关性。结果表明,核酸同源性为99.5%。fimE基因的核苷酸序列中有5个核苷酸残基发生了改变,而预测氨基酸序列变化仅第184位氨基酸由缬氨酸V变为丙氨酸A;其余无核苷酸的变化。

鸡大肠杆菌1型菌毛疫苗的免疫原性

将由DNA-Star软件分析得到的具有1型菌毛抗原差异性的鸡大肠杆菌M10(O11)、GX7(O78)及YR10(O18)株,分别经营养肉汤37 ℃、48 h大容量培养后,提取O18菌毛制成单价1型菌毛油乳剂亚单位疫苗,制备O18全菌灭活疫苗及O11、O78、O18多价灭活疫苗.将4周龄SPF鸡分别免疫接种O18菌毛油乳剂疫苗(每雏菌毛免疫量 200 μg)和O18菌毛菌体灭活疫苗,均隔离饲养至7周龄,进行后胸气囊攻毒.结果表明,未免疫鸡的死亡率为66.67%～88.88%;免疫鸡用同源菌株攻毒死亡率为0;用异源菌株YR17(O2)攻击后死亡率为6.25%～41.17%.另有SPF鸡免疫O11-O78-O18多价菌毛菌体灭活油乳剂疫苗,隔离饲养至7周龄同法攻击,结果显示,免疫鸡用同源混合菌株攻击的死亡率为13.33%,未免疫攻击的死亡率为70.00%;免疫鸡用异源菌株O2攻击的死亡率为3.33%,未免疫鸡为61.53%.表明多价菌毛1型灭活疫苗不仅具有良好的免疫原性,而且具有一定的交叉保护作用.

鸡致病性大肠杆菌O_1、O_2和O_(78)Ⅰ型菌毛结构基因的克隆、序列测定及同源性分析

提取鸡致病性大肠杆菌分离株O1、O2和O78的基因组DNA作模板,用TD-PCR技术从其中分别扩增出0.55KB的I型菌毛结构基因(piliA)。将扩增得到的piliA基因片段,用TA克隆的方法分别克隆进pGEM-T载体中,转化至受体菌JM109中,用Amp/IPTG/X-gal琼脂平板蓝白菌落筛选法,得到含阳性重组子的菌株,提取质粒用PstI单酶切及NcoI和PstI双酶切鉴定,结果证实,所构建的克隆质粒中均含有相应piliA基因。经DNA序列分析,其结构基因阅读框架大小为549bp,但其中O1菌株I型菌毛基因在第72位发生突变,有6个碱基插入。经DNAStar核酸分析软件分析,3个基因同源性为89.9%～92.0%。

尿路致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛fimH基因真核表达质粒的构建及表达

目的 构建以尿路致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛 fimH基因为靶位的真核表达质粒 ,并使其在小鼠肌肉中表达。 方法 应用PCR方法及基因重组技术 ,克隆了尿路致病性大肠杆菌标准菌株J96 fimH基因 ,并将fimH基因插入真核表达载体pcDNA3中。免疫BALB/c小鼠 ,用免疫组化染色法观察表达情况。结果与结论 成功地构建了真核表达质粒pcDNA3-fimH ,序列分析显示 ,fimH基因核苷酸序列与GenBank上登录的一致 ,fimH蛋白在小鼠肌肉组织细胞内呈分散表达。

尿路致病性大肠埃希菌1型菌毛黏附特性与分子流行病学分析

目的了解尿路致病性大肠埃希菌(UPEC)1型菌毛黏附特性、耐药表型及分子流行病学特征,为临床诊疗提供理论基础。方法收集2020年1-11月广东省中医院大学城医院临床分离的80株UPEC,利用VitekⅡ细菌鉴定药敏分析仪鉴定细菌并进行药敏实验。利用PCR方法检测UPEC的1型菌毛fimH基因的携带情况,酵母细胞黏附实验检测UPEC的黏附特性,比较黏附阳性UPEC和黏附阴性UPEC菌株间的抗生素耐药差异。通过随机扩增多态性DNA(RAPD)法分析黏附阳性UPEC间的亲缘关系。结果80株UPEC中1型菌毛fimH基因阳性菌株为74株,占94.5%,其中黏附阳性菌株为37株,占50.0%。黏附阳性UPEC头孢呋辛耐药率(45.9%)和产超广谱β内酰胺酶(ESBL)阳性率(45.9%)均高于黏附阴性UPEC(21.6%、21.6%),差异均有统计学意义(P均<0.05)。37株黏附阳性UPEC可基因聚类,分为18个基因型,其中以R010基因型为主,包含11株UPEC,占29.7%;另外R006基因型包含4株UPEC,占10.8%;其余基因型均包含1~2株菌。结论临床分离的UPEC 1型菌毛fimH基因携带率高,黏附能力强,应用头孢呋辛抗感染治疗时应注意耐药。黏附阳性菌株虽可聚类,但未出现院内流行性感染趋势。

群体感应系统受体SdiA与大肠埃希菌1型菌毛的相关性研究

目的探讨群体感应系统受体SdiA与大肠埃希菌1型菌毛的相关性。方法在有或无群体感应系统信号分子处理下检测大肠埃希菌SM10λpir的野生株、sdiA敲除株和sdiA过表达回复株与酵母细胞的黏附能力,并用荧光定量PCR检测1型菌毛相关基因fimC、fimF的表达情况。转录组测序分析上述菌株1型菌毛相关基因的表达差异。结果群体感应系统信号分子处理组中野生株和sdiA敲除株出现肉眼可见的凝集,强度分别为+和++,而过表达回复株未出现凝集。加入甘露糖后野生株和sdiA敲除株的凝集强度减弱,强度均为±。对照组上述三株菌均未出现凝集。染色镜检发现,与野生株相比较,sdiA敲除株对酵母细胞黏附率较高(P<0.01),sdiA过表达回复株对酵母细胞黏附率较低(P<0.01)。在SdiA差异表达菌株间sdiA敲除株1型菌毛相关基因fimC、fimF表达增高(P<0.05),反之sdiA过表达回复株表达降低(P<0.05)。转录组测序中群体感应系统信号分子处理组菌毛相关基因fimA、fimB、fimC、fimD、fimE、fimF、fimG、fimH、fimI的表达均随着SdiA的表达量增高而降低,反之SdiA低表达,1型菌毛相关基因表达量增高,而在DMSO对照组中,上述基因与SdiA的表达量相关性不明显。结论大肠埃希菌中群体感应系统受体SdiA在信号分子的介导下可通过抑制1型菌毛相关基因的表达,降低细菌的黏附能力。

伤寒杆菌IVB型菌毛对THP-1细胞PKC和ERK及NF-κB活化的影响

目的:初步探讨伤寒杆菌IVB型菌毛对THP-1细胞PKC、ERK、NF-κB活化的影响。方法:将THP-1细胞分别与有IVB型菌毛的A21-6菌、缺失IVB型菌毛的pilS-菌共同孵育,底物磷酸激酶测定法检测PKC活性变化,免疫印迹法检测ERK磷酸化水平,荧光素酶报道基因分析法检测NF-κB激活表达。结果:THP-1细胞经有IVB型菌毛的A21-6菌刺激后,PKC活性变化、ERK磷酸化水平和NF-κB激活表达均显著高于相应的处理组;PKC、ERK、NF-κB活化水平分别于刺激10、30、60min后即明显升高;并分别于30、60、120min左右达到峰值。结论:伤寒杆菌IVB型菌毛显著增强了THP-1细胞PKC、ERK、NF-κB活化水平,IVB型菌毛在伤寒杆菌诱导单核/巨噬细胞PKC、ERK、NF-κB活化过程中是一种重要的强刺激因素。