大肠杆菌pheA与tyrB基因的克隆与串联表达

为探讨用基因工程的手段改良苯丙氨酸的发酵菌株，采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）的方法，从大肠杆菌总ＤＮＡ中克隆得到了编码苯丙氨酸合成途中的两个关键酶基因－－即分枝酸变位酶（ＣＭ）／预苯酸脱水酶（ＰＤ）基因ｐｈｅＡ与苯丙氨酸转氨酶（ＰＡＴ）基因ｔｙｒＢ，在大肠杆菌中进行了这两个基因的单个和串联表达。ｐｈｅＡ和ｔｙｒＢ基因分别都能在λ噬菌体的Ｐ。启动子之后得到较大量的表达，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现清晰的条带，使表达菌体的蛋白抽提物中ＣＭ／ＰＤ和ＰＡＴ的比活分别提高了１４．１倍／７．９倍和３．５倍．当ｐｈｅＡ和ｔｙｒＢ以ｔｙｒＢ－ｐｈｅＡ的形式进行串联表达时，酶的比活分别提高了４．２倍／２．４倍和２．５倍；而以ｐｈｅＡ－ｔｙｒＢ的形式串联表达时，三种酶的比活分别提高了１７．５倍／８．７倍和３．３倍．结果表明，后一种串联方式的表达效果较好．

用于生产L－苯丙氨酸的基因工程菌的构建

本文报道用含ｔｙｒＢ基因（在大肠杆菌中编码芳香族氨基酸转氨酶）的质粒ｐＫＢ７转化不同的突主菌，筛选出ＣＴＢ２菌（ｐＫＢ７转化ＪＭ１０７得到）表达的芳香族氨基酸转氨酶活力最高。进一步研究证明ＣＴＢ２菌在菌浓度为２０ｍｇ／ｍｌ，温度３０℃，反就６０分钟．能催化苯丙酮酸加氨生成大量的Ｌ－苯内氮酸，而没有付产物酪氨酸生戊。以从ＣＴＢ２菌中提取纯化出的质粒为模板，经ＰＣＲ扩增反应可以得到约长１．２ｋｂ的ｔｙｒＢ基因片段，ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳实验表明ＣＴＢ２菌可溶性蛋白在分子量约４００００，有一条明显加深的蛋白区带，这与理论估算的芳香族氨基酸转氨酶的分子量４３０００基本一致。而ＪＭ１０７和含ｐＫＫ２３３－２空质粒的ＪＭ１０７在该位点的区带则没有加深，该加深区带的蛋白含量占到总溶性蛋白的２０％左右。

茶树内生草螺菌ZXN111生长素合成及其对云抗-10号植物的促生功能

【目的】以紫娟茶树分离的内生菌水生草螺菌ZXN111为研究对象,通过分子遗传学方法证实该菌株植物生长素吲哚3-乙酸(IAA)合成的主要分子途径。【方法】参考草螺菌基因组信息中IAA合成基因簇,选取与IAA合成密切相关的候选基因,即芳香族氨基酸转氨酶基因(tyrb),通过基因插入突变与基因互补方法,结合茶树组培苗体内促生能力分析,初步验证水生草螺菌生长素合成的主要机制。【结果】植物生长素IAA合成候选基因tyrb突变后,突变株tyrb::pK19mobΩ2HMB 48 h的IAA合成量显著低于野生型菌株ZXN111,且tyrb基因互补后,互补株tyrb::pK19mobΩ2HMB(+)的IAA合成能力得到了显著恢复。茶树促生实验发现,突变株tyrb::pK19mobΩ2HMB接种组的茶树组培苗根长、根重及植株鲜重指标上均显著低于野生菌处理组。【结论】水生草螺菌ZXN111有多条IAA合成途径,其中的吲哚-3-丙酮酸(IPA)是最主要途径,其生长素合成对寄主茶树具有显著的促生功能。