大肠杆菌ubiA基因的克隆及序列测定

以E.coli JM83染色体DNA为模板PCR扩增ubiA的结构基因,将PCR产物克隆于pUCm-T Vector,对PCR产物进行测序鉴定。与已发表的大肠杆菌ubiA基因序列比较,同源性达99％。

UBIAD1通过抑制nNOS/NO途径减轻氧糖剥夺再灌注损伤

目的:缺血性脑卒中的发病率和致残率均极高,缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)是治疗的关键。UbiA类异戊烯转移酶结构域1蛋白(UbiA prenyltransferase domain containing 1 protein,UBIAD1)是一类具有多种生物学功能的酶,参与线粒体呼吸链电子传递、脂代谢、氧化应激等,这些过程均与IRI有关。本研究探讨UBIAD1在脑IRI中的作用及其作用机制。方法:以小鼠成神经细胞瘤(mouse neuroblastoma Neuro2a,N2a)细胞为研究对象,构建氧糖剥夺再灌注(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)损伤模型,以过表达UBIAD1的慢病毒载体转染N2a细胞,构建稳定过表达UBIAD1的细胞模型。第1部分实验将N2a细胞分为5组:未经OGD处理(non-OGD)组、经OGD处理4 h后分别再灌注0、4、12、24 h组;第2部分实验将N2a细胞分为6组:正常细胞(Con)+non-OGD组、转染空载体细胞(EV)+non-OGD组、UBIAD1过表达细胞(OE)+non-OGD组、Con+OGD处理(OGD/R)组、EV+OGD/R组、OE+OGD/R组;第3部分将N2a细胞分为8组:Con+non-OGD组、OE+non-OGD组、Con+non-OGD+NOS特异性抑制剂7-硝基吲唑(7-nitroindazole,7-NI)组、OE+non-OGD+7-NI组、Con+OGD/R组、OE+OGD/R组、Con+OGD/R+7-NI组、OE+OGD/R+7-NI组。使用激光共聚焦扫描显微镜观察高尔基体形态改变,流式细胞术检测细胞凋亡率,MTT法检测细胞活力,Griess试剂盒检测NO的释放,分别通过real-time PCR和蛋白质印迹法检测细胞UBIAD1、分泌途径衍生钙离子转运ATP酶1(secretory pathway Ca^(2+)-ATPase isoform 1,SPCA1)、NOS的mRNA和蛋白质表达水平。结果:与non-OGD组相比,经OGD处理4 h后再灌注0、4、12及24 h的各组N2a细胞中UBIAD1 mRNA和蛋白质表达水平均明显下调(P<0.05或P<0.01),且再灌注时间越长,UBIAD1表达水平下调越显著。与Con+OGD/R组、EV+OGD/R组相比,OE+OGD/R组UBIAD1 mRNA和蛋白质表达水平均明显上调(均P<0.01),细胞凋亡率均下降(均P<0.01),细胞活力均增高(均P<0.01),高尔基体碎裂较少,形态保存较完整,SPCA1 mRNA和蛋白质表达水平均明显上调(均P<0.05)。OE+non-OGD组与Con+non-OGD组相比,OE+OGD/R组与Con+OGD/R组相比,内皮型NOS(endothelial NOS,eNOS)及神经元型NOS(neuronal NOS,nNOS)的mRNA和蛋白质表达均下调(P<0.05或P<0.01),NO含量均减少(均P<0.01);Con+OGD/R+7-NI组与Con+OGD/R组相比,OE+OGD/R+7-NI组与OE+OGD/R组相比,NO含量均减少(均P<0.01),N2a细胞凋亡率均下降(均P<0.01)。结论:UBIAD1可减轻神经细胞OGD/R损伤,改善OGD/R后高尔基体功能,其机制可能与抑制nNOS/NO途径有关。

基因局部改组技术在ubiA基因突变中的应用

辅酶Q(coenzyme Q,CoQ)作为线粒体呼吸链中的递氢体具有较高的学术及应用价值。由ubiA基因编码的4-羟苯甲酸聚异戊二烯转移酶(UbiA)是大肠杆菌CoQ生物合成途径的限速步骤,但通过系统突变对其结构进行研究鲜有报道。【目的】应用化学合成的随机序列寡核苷酸,对ubiA基因编码活性区域的DNA序列进行随机突变。【方法】以大肠杆菌MC4100的ubiA基因插入灭活突变株为受体,将化学合成的随机序列替换目标区域序列,进行ubiA基因的局部改组;最终对所得突变株的ubiA改组基因的突变序列及其功能进行对应分析。【结果】ubiA基因局部改组后经过两轮筛选,得到CoQ产量发生不同程度变化的7株ubiA基因突变株,与野生型ubiA相比改组型ubiA的编码序列呈显著变化,其测序结果从一个侧面证实了文献报道的3个天冬氨酸位点与ubiA基因所编码蛋白的催化活性之间的关系。【结论】本文建立的基因局部改组技术是可行的;利用该技术初步揭示了UbiA中对其活性具有重要贡献的部分氨基酸位点。

移行上皮反应基因TERE1的结构与功能分析

目的用生物信息软件分析移行上皮反应基因TERE1蛋白的跨膜结构,并预测分析其重要蛋白结构域功能。检测TERE1在细胞中表达定位。方法采用不同生物信息学软件预测分析TERE1的蛋白跨膜结构及重要结构域功能。采用分子克隆方法构建绿色荧光蛋白-移行上皮反应基因(pEGFP-TERE1)重组质粒,转染人膀胱癌细胞系T24,激光共聚焦显微镜观察TERE1在细胞中表达定位。结果 TERE1蛋白为多次跨膜的蛋白,保守的区域形成3个环loop 1、loop 2和loop 3;N端和loop 1含有高度保守的位点;以loop 2和loop 3之间的区域采用PROSITE软件分析显示UbiA类异戊烯转移酶家族具有一致性序列。采用菌液PCR、双酶切鉴定和DNA测序验证pEGFP-TERE1重组质粒构建成功。TERE1主要在T24细胞浆中表达。结论 TERE1为多次跨膜的蛋白,保守的区域形成3个环,UbiA类异戊烯转移酶家族具有一致性序列。TERE1主要在T24细胞浆中表达。

CoQ_(10)生物合成限速酶及其编码基因对布莱凯特黑牛品种培育的实践意义

辅酶Q10(CoQ10)作为人体线粒体呼吸链中的递氢体具有较高的学术研究及应用价值。由ubiA/coq2基因编码的对羟苯甲酸聚异戊二烯焦磷酸转移酶是原核和真核生物CoQ生物合成途径的限速步骤,因此对该酶及其编码基因的研究显得尤为重要。对该酶及其编码基因的研究成果和现状进行综述和展望,旨在为布莱凯特黑牛品种培育的实践研究提供理论指导意义。

施奈德结晶状角膜营养不良致病基因功能的研究进展

施奈德结晶状角膜营养不良(SCCD)是一种罕见的常染色体显性遗传病,临床症状为角膜中脂质异常积累。有研究结果表明,SCCD由UbiA异戊烯基转移酶结构域包含蛋白1(UBIAD1)基因突变引起。UBIAD1突变后分子构型改变,不能与3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶受体(HMGCR)解离,HMGCR不能通过泛素化途径降解,导致HMGCR在内质网膜聚集,胆固醇合成增多,诱发SCCD疾病。本文中笔者就UBIAD1的功能和SCCD致病的分子机制进行重点综述,旨在为SCCD的诊断与治疗提供参考。