pSicoR/miR-17-5p靶向调控UNC-51样激酶1(ULK1)及其对细胞自噬的影响

目的为了探讨miR-17-5p对自噬相关基因ULK1的调控作用及其对细胞自噬的影响,为更深入研究miR-17-5p调控细胞自噬机制建立理论依据。方法构建p Sico R-miR-17-5p过表达重组质粒,包装miR-17-5p过表达慢病毒,构建ULK1及其突变体ULK1-mut的pmiR-report载体,通过双荧光素酶报告系统验证miR-17-5p对ULK1的靶向关系,利用Western blot检测ULK1与LC3B蛋白的表达量。结果成功构建p Sico R-miR-17-5p过表达重组质粒并且成功将ULK1及其突变体ULK1-mut的3′-UTR插入到pmiR-report载体中;双荧光素酶报告系统结果表明转染miR-17-5p及ULK1-3′-UTR,miR-17-5p过表达组相比对照组相对荧光强度降低1.9倍(P<0.05),说明miR-17-5p对ULK1的表达有抑制作用,而转染miR-17-5p及mut-ULK1-3′-UTR之后检测显示相对荧光强度并没有降低,说明miR-17-5p是靶向作用于ULK1,并对其进行负调控;Western blot显示miR-17-5p抑制ULK1蛋白的表达,并且抑制LC3II/I蛋白的表达。结论 miR-17-5p直接靶向作用于自噬相关基因ULK1,并且对其负调控,抑制细胞自噬的发生。

UNC-51样激酶1在食管癌组织中的表达及其意义

目的:观察食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)组织中UNC-51样激酶1(UNC-51-like kinase 1,ULK1)的表达情况,并分析其与ESCC患者临床病理特征和生存期的关系。方法:利用组织芯片技术结合免疫组化法检测94例食管癌组织以及78例相应癌旁组织中ULK1蛋白的表达。结果:食管癌组织中ULK1细胞质表达水平显著高于癌旁组织(P <0. 01),且与淋巴结转移有明显相关性(P <0. 05)。生存分析显示,ULK1低表达的ESCC患者生存率明显低于高表达者(风险比为1. 754,95%CI:1. 022～3. 010,P=0. 041)。结论:ULK1在ESCC中异常表达,并且ULK1低表达ESCC患者的生存期较差,ULK1可能是ESCC潜在的分子标志物。

胎盘ULK1表达与自噬及子痫前期的相关性研究

目的比较子痫前期与正常产妇胎盘组织中Unc-51样激酶1(ULK1)表达和自噬水平,分析胎盘ULK1表达与自噬水平及子痫前期病情的相关性。方法选择2021年3月至2023年5月于福建省立医院分娩的25例子痫前期患者作为子痫前期组,同期住院且年龄、产次与分娩方式相配对的25例正常产妇作为对照组。免疫组织化学检测两组产妇胎盘组织中自噬标志蛋白微管相关蛋白1A/1B-轻链3B(LC3B)、苄氯素1(Beclin1)、螯合体1(SQSTM1/p62)和ULK1蛋白的表达水平,实时荧光定量PCR检测胎盘组织ULK1的mRNA表达,电化学发光法检测子痫前期患者外周血可溶性类fms酪氨酸激酶-1(sFlt-1)和胎盘生长因子(PlGF),采用Pearson法分析ULK1表达与sFlt-1/PlGF比值的相关性。结果免疫组织化学检测结果显示,对照组与子痫前期组胎盘均可见LC3B、Beclin1和p62表达,经半定量分析结果显示,子痫前期组产妇胎盘组织的LC3B和Beclin1表达相对量分别为695.32±77.82、534.19±77.60,明显高于对照组的630.11±64.14和438.66±91.71,p62表达相对量为529.66±85.62,明显低于对照组的638.37±127.62,差异均有统计学意义(P<0.05);经实时荧光定量PCR检测结果显示,子痫前期组产妇胎盘组织ULK1的mRNA表达水平1.01±0.13,明显高于对照组的0.86±0.08,差异有统计学意义(P<0.01);子痫前期组外周血PlGF和sFlt-1水平分别为(114.12±21.71)pg/mL和(8274.126±3453.49)pg/mL,sFlt-1/PlGF比值平均为81.94±57.84,经Pearson相关性分析表明,子痫前期组胎盘组织ULK1的mRNA表达水平与外周血sFlt-1/PlGF比值呈正相关(r=0.701,P<0.05)。结论子痫前期患者胎盘组织ULK1的表达水平明显上升,与自噬水平一致,并与子痫前期严重程度密切相关,有望作为子痫前期防治的新靶点。

鱼藤酮激活AMPK-ULK1信号通路诱导大鼠胸主动脉内皮细胞自噬

目的探讨鱼藤酮对大鼠胸主动脉内皮细胞(RTAEC)自噬的影响及其初步机制。方法选用60只雄性SD大鼠,随机分为对照(Con)组、二甲基亚砜(DMSO)组和鱼藤酮组[1、2、4 mg·(kg·d)^(-1)],各组分别干预28 d。实验前后分别记录大鼠体质量、血压和心率;HE染色观察胸主动脉和心脏组织病理生理改变,透射电镜观察其超微结构及自噬小体发生。细胞实验分组:Con组、DMSO组和鱼藤酮组(20、100和500 nmol·L^(-1)),分别处理24 h,用活性氧(ROS)和三磷酸腺苷(ATP)水平筛选鱼藤酮干预最佳浓度后,选取500 nmol·L^(-1)进行后续干预。腺苷酸激活的蛋白激酶(AMPK)抑制剂化合物C(CC)在鱼藤酮处理前2 h干预细胞;RT-qPCR和Western blot检测胸主动脉自噬相关因子及腺苷酸激活的蛋白激酶-UNC-51样激酶1(AMPK-ULK1)通路的改变。结果与DMSO组相比,鱼藤酮组体质量增长量减少(P均<0.01);鱼藤酮对大鼠的血压和心率没有影响(P均>0.05);HE结果显示,鱼藤酮组胸主动脉内皮细胞伴有缺损,且心脏组织纤维排列紊乱、断裂;透射电镜结果发现,鱼藤酮组胸主动脉和心脏组织伴有结构异常及自噬小体出现;随着RTAEC鱼藤酮干预浓度增大,ROS产生水平增加(P<0.01),而ATP的生成减少(P<0.01);RT-qPCR结果显示,与DMSO组相比,LC3和P62的mRNA表达水平均上调(P均<0.01);信号通路相关因子AMPK和ULK1的mRNA表达水平均增加(P均<0.01);加入AMPK抑制剂CC,Western blot检测自噬相关蛋白,与500 nmol·L^(-1)组相比,LC3表达降低(P<0.01),P62表达上调(P<0.01);AMPK和p-AMPK表达减少(P均<0.01),AMPK的下游因子ULK1及p-ULK1表达均减少(P均<0.01)。结论鱼藤酮可促进RTAEC发生自噬,而其自噬机制可能是通过AMPK-ULK1信号通路介导。

大黄糖络丸通过AMPK/mTOR/ULK1通路调控糖尿病肾病小鼠足细胞自噬的作用机制研究

目的:探究大黄糖络丸(DHT)基于腺苷酸活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/unc-51样激酶1(AMPK/mTOR/ULK1)信号通路对糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)小鼠的干预作用。方法:40只造模成功的C57BL/KSJ-db/db(以下简称db/db)小鼠随机分为模型组,达格列净组(1.5 mg·kg^(-1)·d^(-1)),DHT高、中、低剂量组(3.6、1.8、0.9 g·kg^(-1)·d^(-1)),每组8只;另取10只C57BL/KSJ-db/dm(以下简称db/m)小鼠为正常组,正常组和模型组给予生理盐水,治疗组小鼠分别给予相应药物,连续给药10周,1次/d。于给药0、4、8、10周固定时间,禁食不禁水12 h,取尾静脉血检测空腹血糖(FBG);于给药0、5、10周末收集尿液检测尿中白蛋白、肌酐含量,计算尿白蛋白肌酐比值(ACR);给药10周后,检测各组小鼠24 h尿总蛋白,血肌酐(Scr),尿素氮(BUN)含量;蛋白免疫印迹法检测肾脏组织p-AMPK、p-mTOR及p-ULK1蛋白的表达水平,以及自噬关键分子酵母Atg6同系物1(Beclin-1)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)、P62蛋白的表达水平;免疫组化法检测肾脏组织足细胞裂孔膜蛋白(Nephrin、Podocin)的表达水平;采用光学显微镜和透射电镜观察肾脏组织病理形态学变化。结果:与模型组比较,达格列净组和DHT组小鼠FBG、ACR、24 h尿总蛋白均降低,Scr、BUN无统计学差异;肾组织中p-AMPK、p-ULK1表达水平升高,p-mTOR表达水平降低及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1表达水平升高,P62表达水平降低(P<0.01,P<0.05);肾小球的足细胞裂孔膜蛋白Nephrin、Podocin表达水平升高(P<0.01,P<0.05);肾脏病理损害减轻;透射电镜显示自噬小体、自噬溶酶体数量增加。结论:DHT可能通过调控AMPK/mTOR/ULK1信号通路,增强足细胞自噬,保护肾小球,延缓DN发展进程。

激酶ULK1对急性T淋巴细胞白血病细胞凋亡作用的研究

目的 探讨ULK1对急性T淋巴细胞白血病细胞株CEM-C7凋亡的影响及与AMPKα/ULK1轴之间的关系。方法 通过予不同浓度ULK1激活剂LYN-1604(0、1.2、2μmol/L)、ULK1抑制剂MRT68921(0、1.2、2μmol/L)干预CEM-C7细胞24 h,流式细胞术检测各药物浓度对CEM-C7细胞株凋亡率的影响,筛选凋亡最明显的药物浓度进行后续实验,Edu及Soft agar实验检测其对CEM-C7细胞株增殖的影响,流式细胞术检测其对CEM-C7细胞株线粒体膜电位的影响,透射电镜观察其对CEM-C7细胞细胞核及线粒体超微结构变化的影响,Western blot检测激活和抑制ULK1后ULK1、p-ULK1(Ser317)、Caspase3、Cleaved-caspase3、Bcl-2、Bax、PCNA、AMPKα、p-AMPKα(Ser172)的表达情况。结果 ULK1抑制剂及激活剂分别干预CEM-C7细胞24 h以后,与对照组相比,ULK1抑制剂可明显促进CEM-C7细胞发生凋亡,抑制CEM-C7细胞增殖,使细胞线粒体的膜电位明显下降,差异均具有统计学意义(P<0.05);透射电镜可观察到明显的细胞凋亡现象;p-ULK1(Ser317)、p-AMPKα(Ser172)的蛋白水平表达下降,而ULK1激活剂对CEM-C7细胞株无明显影响。结论 ULK1可能通过AMPKα/ULK1轴影响其对CEM-C7细胞的凋亡功能。

橙皮素抑制TLR4-mTOR-ULK1信号通路对心肌缺血再灌注损伤大鼠细胞自噬和凋亡的影响

目的 探讨橙皮素(HES)对心肌缺血再灌注损伤(MIRI)大鼠细胞自噬与凋亡的影响,并初步分析其机制。方法 将SD大鼠分为假手术(Sham)组、MIRI组、低剂量HES(HES-L,15 mg/kg)组、高剂量HES(HES-H,30 mg/kg)组和HES-H+Toll样受体4(TLR4)抑制剂(HES 30 mg/kg+复合物C 0.2 mg/kg)组。连续给药7 d,除Sham组外,大鼠采用冠脉结扎法构建MIRI模型,24 h后检测左心室血流动力学参数[包括左室舒张期末压(LVEDP)、左室内压最大上升速率(dp/dtmax)、左室内压最大下降速率(-dp/dtmax)];采用原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测心肌细胞凋亡,氯化三苯基四氮唑(TTC)染色检测心肌梗死(心梗)面积,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测心肌组织中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD);Western blotting检测大鼠心肌组织中微管相关蛋白1-轻链3(LC3)Ⅱ、LC3Ⅰ、自噬效应蛋白(Beclin1)、TLR4、磷酸化(p)-TLR4、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、p-mTOR、unc-51样自噬激活激酶1(ULK1)、p-ULK1蛋白表达。结果 与Sham组比较,MIRI组大鼠心肌细胞线粒体损伤、自噬空泡形成;LVEDP[mmHg(1 mmHg≈0.133 kPa):14.22±2.12比5.44±0.83]、心肌细胞凋亡率[(31.52±4.01)%比(2.41±0.26)%]、心梗面积(mm2:43.68±3.86比0.00)、心肌组织MDA(ng/L:8.25±1.03比3.71±0.65)、p-mTOR/mTOR(0.76±0.08比0.33±0.04)、p-ULK1/ULK1(0.69±0.08比0.22±0.03)均显著升高,dp/dtmax(mmHg/s:3 441.43±289.25比4 910.57±350.12)、-dp/dtmax(mmHg/s:2 588.96±260.23比3 845.94±364.19)、心肌组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ(1.13±0.14比2.35±0.21)、Beclin1(0.35±0.06比0.87±0.09)、p-TLR4/TLR4(0.40±0.05比0.84±0.10)均显著降低(均P <0.05)。与MIRI组比较,HES-L、HES-H组大鼠线粒体损伤缓解,自噬空泡少见;LVEDP(mmHg:11.56±1.60、7.88±1.21比14.22±2.12)、心肌细胞凋亡率[(25.52±3.11)%(、17.54±1.89)%比(31.52±4.01)%]、心梗面积(mm2:36.67±3.58、29.58±3.04比43.68±3.86)、心肌组织MDA(ng/L:6.98±0.65、4.12±0.48比8.25±1.03)、p-m TOR/m TOR(0.60±0.07、0.45±0.05比0.76±0.08)、p-ULK1/ULK1(0.54±0.05、0.32±0.04比0.69±0.08)均显著降低,dp/dtmax(mmHg/s:3 972.82±310.17、4 442.97±396.24比3 441.43±289.25)、-dp/dtmax(mmHg/s:3 152.30±312.18、3 430.57±324.24比2 588.96±260.23)、心肌组织中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ(1.76±0.18、2.01±0.20比1.13±0.14)、Beclin1(0.56±0.07、0.79±0.08比0.35±0.06)、p-TLR4/TLR4(0.55±0.06、0.73±0.08比0.40±0.05)均显著升高(均P <0.05)。结论 HES可通过抑制TLR4-m TOR-ULK1信号通路促进MIRI大鼠心肌细胞自噬,抑制凋亡。

白桦脂酸调节AMPK/mTOR/ULK1信号通路对冠心病大鼠血管平滑肌细胞自噬和凋亡的影响

目的探究白桦脂酸通过调节腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/Unc-51样自噬激活激酶1(ULK1)信号通路对冠心病大鼠血管平滑肌细胞自噬和凋亡的影响。方法原代培养冠心病大鼠血管平滑肌细胞,将其随机分为正常组(Control组)、模型组(Model组)、低浓度(20μmol/L)白桦脂酸组(BA-L组)、高浓度(40μmol/L)白桦脂酸组(BA-H组)和高浓度(40μmol/L)白桦脂酸+AMPK抑制剂(10μmol/L)Compound C组(BA-H+CC组)。CCK-8法检测大鼠血管平滑肌细胞的细胞活力。流式细胞术检测细胞凋亡。mRFP-GFP-LC3双荧光体系示踪大鼠血管平滑肌细胞的自噬小体。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)实验检测大鼠血管平滑肌细胞中AMPK、mTOR、ULK1 mRNA的表达。Western blot实验检测大鼠血管平滑肌细胞中AMPK、mTOR、ULK1、LC3、Bax、Bcl-2、Beclin-1蛋白表达水平。结果与Control组相比,Model组血管平滑肌细胞的细胞活力(48 h、72 h)、Bcl-2蛋白表达、mTOR mRNA和蛋白表达显著上升(P<0.05),细胞凋亡率、Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表达、AMPK及ULK1 mRNA和蛋白表达显著下降(P<0.05)。与Model组相比,BA-H组血管平滑肌细胞的细胞活力(48 h、72 h)、Bcl-2蛋白表达、mTOR mRNA和蛋白表达显著下降(P<0.05),细胞凋亡率、Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表达、AMPK及ULK1 mRNA和蛋白表达显著上升(P<0.05)。Compound C减弱了白桦脂酸对血管平滑肌细胞自噬和凋亡的促进作用(P<0.05)。结论白桦脂酸可能通过激活AMPK/mTOR/ULK1信号通路促进冠心病大鼠血管平滑肌细胞的自噬和凋亡。

金果胃康胶囊对胃癌前病变模型大鼠胃黏膜ULK1/AMPK/mTOR信号通路的影响

目的:探讨金果胃康胶囊对胃癌前病变(PLGC)大鼠UNC-51样激酶1(ULK1)/5’-单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的影响。方法:75只SPF级Wistar大鼠,除空白组外,采用MNNG复合造模法建立PLGC大鼠模型,造模成功后运用随机数字表法分为模型组、叶酸组及金果胃康高、中、低剂量组,每组12只。灌胃给药8周后取材。HE染色观察胃黏膜病理学变化,免疫组化法检测ULK1蛋白表达水平,qPCR检测胃组织AMPK、mTOR mRNA表达水平,Western blot检测胃组织AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR蛋白表达水平。结果:金果胃康胶囊可显著改善PLGC大鼠胃黏膜萎缩、肠化生、上皮结构、形态紊乱及细胞异型性等病理表现。与模型组比较,金果胃康胶囊能显著上调AMPK、p-AMPK、ULK1的表达水平,下调mTOR、p-mTOR的表达水平(P<0.05),以高剂量组疗效最为显著。结论:金果胃康胶囊可能通过调控ULK1/AMPK/mTOR信号通路促进细胞自噬,修复胃黏膜病变,从而起到防治PLGC的作用。

内质网应激介导巨噬细胞极化分子机制研究进展

内质网(ER)是维持细胞内Ca 2+稳态、折叠新合成的分泌蛋白和膜蛋白以及蛋白质翻译后修饰的重要细胞器。ER腔内错误折叠与未折叠蛋白聚集,可激活内质网应激(ERS),进而激活蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、需肌醇酶1α(IRE-1α)和活化转录因子6(ATF6)三个不同的下游信号通路影响细胞的存活、分化和表型转换。近年来研究表明ERS下游信号级联反应与诱导巨噬细胞向促炎性M1型极化(IFN-γ和LPS)和抗炎性M2型极化(IL-4和IL-10)的信号通路之间存在密切相互作用,但两者之间的具体分子机制错综复杂。文中总结了ERS介导巨噬细胞极化的主要机制,重点讨论了ERS的三个不同下游信号影响巨噬细胞极化的分子机制。

ULK1对肝癌细胞生长的调节及其抑制剂对细胞增殖的影响

目的探讨UNC-51样激酶1(ULK1)在肝细胞癌(HCC)中的表达及预后,敲减ULK1或抑制ULK1激酶的活性是否可以抑制肝癌细胞增殖、诱导凋亡并增强奥沙利铂的敏感性。方法在在线数据库中分析ULK1在泛癌和HCC中的表达和预后;定量实时聚合酶链反应验证不同ULK1敲减序列的敲减效率;CCK8法检测敲减ULK1对肝癌细胞系HepG2增殖能力的影响;CCK8法检测ULK1抑制剂和奥沙利铂对HepG2细胞增殖的影响;流式细胞术探讨奥沙利铂与ULK1抑制剂联合对HepG2细胞凋亡的影响;免疫印记法实验检测奥沙利铂与ULK1抑制剂联合对HepG2细胞自噬的影响。结果ULK1在HCC中高表达且与患者预后呈负相关;在HepG2细胞中成功敲减ULK1基因;敲低ULK1可降低HepG2细胞增殖能力;ULK1抑制剂和奥沙利铂联合可抑制HepG2细胞增殖,同时增加HepG2细胞凋亡数量;其机制可能与增强HepG2细胞自噬有关。结论敲低ULK1或使用ULK1抑制剂,可抑制HepG2细胞增殖并诱导凋亡,或有可能增强化疗药物毒性作用,其机制可能与细胞自噬的调控有关。

细胞自噬与ULK1蛋白关系的研究进展

细胞自噬是生物体重要的代谢过程,在各个生理、病理过程中扮演重要角色。它由自噬相关蛋白控制,受多条信号通路调控。细胞自噬在神经退行性病变、肿瘤发生、缺血/再灌注损伤、糖尿病、循环系统疾病等方面有重要作用,其可以清除细胞内受损的物质或细胞器,为细胞提供原料和良好的细胞环境。而在细胞自噬的形成过程中,unc-51样激酶1(ULK1)蛋白发挥重要作用,它是细胞自噬的起始开关。因此,通过对ULK1蛋白上下游信号的深入研究,以ULK1蛋白为治疗靶点,干预和调控细胞自噬,将为疾病的治疗提供新的方向。

自噬启动因子ULK1的生物学功能与靶向治疗研究进展

UNC-51样激酶1(ULK1)作为一种丝氨酸/苏氨酸激酶是哺乳动物中的自噬启动因子,也是酵母中Atg1的同源蛋白.近年来,大量研究揭示了ULK1的结构特征及其生物学功能,并阐明了其调控自噬的途径及其与多种疾病的关系.最新研究还发现了一系列直接或间接靶向ULK1调节自噬的小分子化合物,为开发靶向自噬的新候选药物提供了线索.该文综述了ULK1作为自噬启动因子的复杂生物学功能、与多种疾病的关系及其潜在的靶向治疗应用.

基于AMPK/ULK1介导的自噬探讨牡荆素对鼻咽癌CNE-2细胞裸鼠移植瘤生长抑制作用及其机制

目的探究牡荆素对鼻咽癌CNE-2细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用及其可能的调控机制。方法将BALB/c裸鼠通过左侧前肢腋窝下接种CNE-2细胞构建鼻咽癌裸鼠成瘤模型,待模型构建成功后随机分为模型组、牡荆素组(5、10 mg/kg)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)激动剂组(AICAR,200 mg/kg)、牡荆素+AMPK抑制剂组(Compound C,20 mg/kg),每组各10只。牡荆素组分别按照相应剂量ig;AICAR组ip 200 mg/kg AICAR;牡荆素+Compound C组采取ig 10 mg/kg牡荆素的同时ip 20 mg/kg Compound C,以上各组连续给药21 d。给药结束后测定裸鼠移植瘤体积和质量;苏木素–伊红(HE)染色观察移植瘤组织病理学改变;TUNEL染色检测肿瘤组织细胞凋亡情况;免疫组织化学检测肿瘤组织微管相关蛋白轻链3(LC3)-II、泛素结合蛋白(p62)蛋白表达;免疫荧光检测肿瘤组织LC3-II和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)表达;Western blotting检测肿瘤组织Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Casapse-3蛋白及AMPK/UNC-51样激酶1(ULK1)通路相关蛋白相对表达。结果与模型组相比,牡荆素各剂量组、AICAR组肿瘤生长缓慢,肿瘤体积和质量均显著降低(P<0.05);肿瘤细胞凋亡率,Caspase-3、LC3-II、Bax/Bcl-2、p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1蛋白表达均显著升高,p62蛋白表达均显著降低(P<0.05)。与牡荆素10 mg/kg组相比,牡荆素+Compound C组肿瘤生长良好,肿瘤体积和质量均增加(P<0.05),肿瘤细胞凋亡率,Caspase-3、LC3-II、Bax/Bcl-2、p-AMPK/AMPK、P-ULK1/ULK1蛋白表达均显著降低,p62蛋白表达均显著升高(P<0.05)。结论牡荆素能够抑制鼻咽癌CNE-2细胞裸鼠移植瘤生长,其机制与激活AMPK/ULK1通路介导的自噬,促进肿瘤细胞凋亡相关。

肝豆扶木汤通过调控miR-29b-3p/ULK1表达对Wilson病肝纤维化小鼠自噬的影响

目的:探讨肝豆扶木汤(GDFMD)在Wilson病肝纤维化发展过程中的作用机制及途径。方法:将30只毒性乳突变小鼠(TX-j)随机分为模型组、GDFMD高、中、低剂量组、青霉胺组,每组6只,另随机选取6只野生型小鼠作为正常组,GDFMD高、中、低剂量组予13.92、6.96、3.48 g·kg^(-1)药物进行灌胃。青霉胺组予0.1 g·kg^(-1)青霉胺药物进行灌胃。模型组和正常组用等容积的生理盐水,每天1次,连续灌胃4周。灌胃4周后收集样本,采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测Ⅲ型前胶原肽(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(ColⅣ)、透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN);苏木素-伊红(HE)、马松(Masson)及苦味酸-天狼星红胶原(Sirus Red)染色观察肝纤维化组织病理学改变。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)、免疫组化和蛋白免疫印迹法(Western blot)观察肝星状细胞(HSCs)活化相关指标α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)表达。采用Real-time PCR观察miR-29b-3p表达;Western blot观察Unc-51样自噬激活激酶1(ULK1)及其下游相关因子的表达。应用双荧光素酶报告基因检测方法对miR-29b-3p下游基因进行了验证。结果:与正常组比较,模型组肝纤维化4项(PCⅢ、ColⅣ、HA、LN)显著异常(P<0.01),病理明显异常,HSCs活化相关指标α-SMA、ColⅠ及α-SMA、ColⅠmRNA表达上调(P<0.05,P<0.01),miR-29b-3p表达下调(P<0.01),ULK1、磷酸化(p)-ULK1、自噬相关基因13(Atg13)、p-Atg13、Beclin-1、FAK家族激酶200 kDa相互作用蛋白(FIP200)、激活分子BECN1调节的自噬蛋白1(AMBRA1)、微管相关蛋白1轻链3Ⅱ/Ⅰ(LC3Ⅱ/Ⅰ)上调(P<0.05,P<0.01),p62蛋白表达下调(P<0.01)。与模型组比较,GDFMD高、中、低剂量组及青霉胺组肝纤维化4项显著改善(P<0.01),病理状况改善,HSCs活化相关指标α-SMA、ColⅠ及α-SMA、ColⅠmRNA表达下调(P<0.05,P<0.01),miR-29b-3p表达上调(P<0.01),ULK1、p-ULK1、Atg13、p-Atg13、Beclin-1、FIP200、AMBRA1、LC3Ⅱ/Ⅰ下调(P<0.05,P<0.01),p62蛋白表达上调(P<0.01)。预测软件预测出miR-29b-3p与ULK1存在结合位点。双荧光素酶报告基因检测方法提示ULK1-WT质粒转染的细胞组在加入miR-29b-3p模拟物共培养时,荧光素酶活性降低(P<0.01)。结论:肝豆扶木汤能够通过上调miR-29b-3p,从而调控ULK1介导的细胞自噬,进一步发挥抗Wilson病肝纤维化作用。

益气活血养阴清热方对糖尿病肾病大鼠肾组织自噬信号通路AMPK/mTOR/ULK1的影响

目的:观察益气活血养阴清热方对糖尿病肾病(DN)大鼠肾组织损伤及单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/UNC-51样激酶1(ULK1)(AMPK/mTOR/ULK1)信号通路的影响,探讨其治疗DN的可能作用机制,为临床应用益气活血养阴清热方治疗DN提供客观的理论依据。方法:将90只SPF级雄性SD大鼠采用随机数字表法分为正常对照组和造模组,分别给予普通饲料、高糖高脂饲料喂养。6 w后造模组大鼠一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)建立DN模型,模型制备成功后随机分为模型对照组、益气活血养阴清热方7.7、15.3、30.6 g/kg组、厄贝沙坦0.017 g/kg组。给药后检测大鼠空腹血糖(FBG)、24 h尿蛋白(24 h-UTP)、肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)含量;HE染色、Masson染色、碘酸六胺银(PASM)染色观察肾组织病理变化;透射电镜观察肾组织超微结构变化;免疫组化法(IHC)检测大鼠肾组织自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)、肌球蛋白样BCL2结合蛋白(Beclin 1)表达水平;Western blot法检测大鼠肾组织AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、ULK1、p-ULK1蛋白表达;Real-time PCR法检测大鼠肾组织Ampk、Mtor、Ulk1 mRNA表达。结果:与正常对照组比较,模型对照组大鼠FBG、Scr、BUN、24 h-UTP含量显著升高(P<0.01),肾小球增大,基底膜增厚,系膜基质增生,毛细血管扩张明显,足突融合,LC3Ⅱ、Beclin 1蛋白表达水平显著降低(P<0.01);AMPK、p-AMPK、ULK1、p-ULK1蛋白表达明显下调(P<0.05或P<0.01),p-mTOR、mTOR蛋白表达显著上调(P<0.01);Ampk、Ulk1 mRNA表达显著下调(P<0.01),Mtor mRNA表达显著上调(P<0.01);与模型对照组比较,益气活血养阴清热方30.6 g/kg组大鼠FBG、Scr、BUN、24 h-UTP含量显著降低(P<0.01);肾小球增大减轻,肾组织病理变化改善,同时可见明显的自噬溶酶体,LC3Ⅱ、Beclin 1蛋白表达显著升高(P<0.01);AMPK、p-AMPK、ULK1、p-ULK1表达显著上调(P<0.01),mTOR、p-mTOR表达显著下调(P<0.01);Ampk、Ulk1 mRNA表达显著上调(P<0.01),Mtor mRNA表达显著下调(P<0.01)。结论:益气活血养阴清热方能够缓解DN大鼠肾组织损伤,其机制可能与调控AMPK/mTOR/ULK1信号通路介导的肾组织自噬有关。

当归芍药散对MAFLD大鼠AMPK/mTOR/ULK1自噬信号通路的调节作用

目的:观察当归芍药散对代谢相关脂肪性肝病(MAFLD)大鼠腺苷酸活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/Unc-51样激酶1(AMPK/mTOR/ULK1)信号通路的调控作用,探讨其对MAFLD大鼠的治疗作用及机制。方法:60只SD大鼠随机分为正常组、模型组、西药组(多烯磷脂酰胆碱胶囊,0.144 g·kg^(-1))及当归芍药散低、中、高剂量组(2.44、4.88、9.76 g·kg^(-1))。采用高脂饲料连续喂养8周后,各用药组给予相应药物治疗4周。给药结束后,收集血清和肝组织用于后续实验检测。结果:与正常组比较,模型组大鼠血清胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)和肝组织TC、TG、游离脂肪酸(FFA)的含量或活性均显著升高(P<0.01),低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量显著降低(P<0.01),肝组织磷酸化(p)-AMPK、微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)Ⅱ、Beclin1和ULK1蛋白表达水平均显著降低(P<0.01),p-mTOR和泛素结合蛋白p62蛋白表达水平显著升高(P<0.01),肝细胞出现脂肪性变,NAFLD活动度评分(NAS)和油红O染色面积均明显升高(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,当归芍药散可降低血清TC、TG、ALT、AST和肝组织TC、TG、FFA的含量或活性及p-mTOR和p62蛋白表达水平(P<0.01),升高血清HDL-C含量及肝组织p-AMPK、LCBⅡ、Beclin1和ULK1蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01),改善肝组织脂肪性变,降低NAS和油红O染色面积(P<0.05,P<0.01)。结论:当归芍药散对MAFLD大鼠有治疗作用,其机制可能与调节AMPK/mTOR/ULK1信号通路,增强自噬有关。

力竭运动对小鼠骨骼肌细胞自噬的影响及相关调节机制研究

目的:研究力竭运动对C57BL/6小鼠骨骼肌细胞自噬的影响,并探讨AMPK在骨骼肌自噬中的作用和调节机制。方法:8周龄C57BL/6小鼠96只,随机分为AICAR注射组,力竭运动组,Compound C注射+力竭运动组及相应对照组。各组小鼠分别在AICAR注射后1h,2h和6h或在进行终强度为11m/min的力竭跑台运动后即刻,3h,6h,12h,24h取材,每组6只。通过ELISA法测定AMPK酶活性,采用Western Blot法测定p-ULK1,ATG 7,LC3,Beclin1和p62蛋白表达,免疫共沉淀法测定AMPK/ULK1结合量。结果:AICAR注射后1h时AMPK酶活性、p-ULK1、AMPK/ULK1结合量、LC3-I和LC3-II显著升高(P<0.05),LC3-II/LC3-I比值显著增大(P<0.01),ATG 7、Beclin1显著下降(P<0.05),p62变化不明显,2h时除LC3-II显著下降外(P<0.01),其余指标基本恢复;力竭运动组AMPK酶活性,p-ULK1、AMPK/ULK1结合量,LC3-I和LC3-II运动结束即刻增加非常显著(P<0.01),LC3-II/LC3-I比值显著增大(P<0.01),恢复期(3h、6h、12h、24h)显著下降(P<0.01),ATG 7、Beclin1和p62运动后即刻显著下降(P<0.05),恢复期ATG 7始终低于对照组,Beclin1和p62逐渐恢复;Compound C注射+力竭运动组AMPK活性,p-ULK1含量和AMPK/ULK1结合量基本不变,LC3-I,LC3-II和LC3-II/LC3-I比值在运动后变化同力竭组一致,但显著低于力竭组(P<0.05),ATG 7,Beclin1变化同力竭组,但显著高于力竭组(P<0.05),p62在运动后即刻显著升高,恢复期(3h、6h、12h、24h)显著下降(P<0.05)。结论:AMPK是骨骼肌内细胞自噬的重要调节因子,力竭运动可以通过AMPK/ULK1途径显著提高骨骼肌细胞自噬水平,但AMPK/ULK1并非是调节骨骼肌细胞自噬的唯一途径。

营养信号通路调节细胞自噬的研究进展

营养缺乏的主要细胞反应之一是自噬上调。营养相关信号如细胞内氨基酸、ATP和氧含量等与细胞内合成和分解代谢过程的平衡密切相关。关键营养敏感激酶雷帕霉素靶蛋白复合物1(m TORC1)和单磷酸腺苷依赖蛋白激酶(AMPK)是营养相关自噬的主要信号通路。细胞内的营养情况通过失调51样激酶(ULK)和磷脂酰肌醇3激酶3型催化亚基(VPS34)激酶复合物的协调调节自噬。m TORC1、AMPK、ULK和VPS34之间的广泛交叉和反馈环在自噬诱导和保持细胞稳态中具有重要作用。本文主要描述细胞内营养状态(氨基酸、糖和氧)发生改变时自噬调节的研究进展。

骨质疏松分子生物学研究专家共识

骨质疏松分子生物学研究在骨代谢分子信号通路、骨质疏松易感基因、骨质疏松相关蛋白、骨质疏松靶向治疗等方向取得了很大进展。核因子κB受体活化因子/核因子κB受体活化因子配体/骨保护素(RANK/RANKL/OPG)信号通路、核因子κB受体活化因子(NF-κB)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶(MAPK/ERK)信号通路、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)信号通路、钙离子(Ca^(2+))信号通路、酪氨酸激酶、蛋白激酶B(Src、Akt)信号通路、蛋白激酶C(PKC)信号通路等骨代谢重要通路,维生素D受体(VDR)基因、低密度脂蛋白相关蛋白5(LRP5)基因、亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因、雌激素受体(ER)基因等易感基因,载脂蛋白E(Apo E)、Klotho蛋白(Klotho)、骨形态发生蛋白(BMP)、骨涎蛋白(BSP)等相关蛋白,以直接或间接的方式参与调控骨代谢,作用重叠相互联系,互为结果,已在本专业领域达成共识。