双波长比值光谱法测定5'-鸟苷酸钠、5'-肌苷酸钠、5'-尿苷酸钠含量

依据5'-鸟苷酸钠、5'-肌苷酸钠和5'-尿苷酸钠三组分的比值光谱特征,以尿苷酸钠为干扰组分时,选择258、285、244、280nm作为测定鸟苷酸钠和肌苷酸钠的波长;以肌苷酸钠为干扰组分时,选择211、241nm作为测定尿苷酸钠的波长。结果显示鸟苷酸钠在0.15～5mg/100ml,肌苷酸钠在0.2～6mg/100ml,尿苷酸钠在0.25～4mg/100ml范围具有良好的线性关系,平均回收率分别为100.2%、100.2%和99.5%。本法具有测定波长少、计算简单、光谱"分离"能力强以及能在低档分光光度计上实现、易于推广等特点。

乙醇-水混合溶剂中5′-尿苷酸二钠的结晶介稳区

采用双光路激光法,在293.2-318.2K温度范围内,研究了5＇-尿苷酸二钠在不同比例乙醇-水混合溶剂中的溶解与超溶解特性,得到了5＇-尿苷酸二钠的结晶介稳区。采用λh方程关联了4个体系的溶解度数据,进而分别求得各体系下的混合焓和结晶焓。同时,探讨了搅拌转速、pH值和钠离子浓度对结晶介稳区的影响。实验结果表明,与温度相比较,乙醇质量分数是影响溶解度和超溶解度的主要因素;随乙醇质量分数的增大,5＇-尿苷酸二钠的溶解度和超溶解度显著减小;在相同条件下,溶液pH值和钠离子浓度的升高,以及搅拌转速的降低均会增大5＇-尿苷酸二钠结晶介稳区的宽度。

乙醇-水溶剂中5′-尿苷酸二钠溶解度测定与关联

采用内置双光路激光检测器,在293.2—318.2 K温度范围内,测定了5′-尿苷酸二钠在纯水及不同乙醇-水混合溶剂中的溶解度。分别用R-K方程、λh方程和Wilson方程3种溶解度模型,采用最小二乘法关联实验数据,并对比不同溶解度模型。结果表明,在乙醇质量分数为0—0.65区间内,5′-尿苷酸二钠溶解度随着温度的升高而增大,随乙醇质量分数的增大而显著减小,λh方程对5′-尿苷酸二钠溶解度关联效果最好。将λ,h表达为乙醇质量分数的函数,并用于内插计算,精度满足工程要求。

从RNA酶解液中分离5′-尿苷酸

采用2根强酸性阳离子交换柱、1根弱碱性阴离子交换柱和1根强碱性阴离子交换柱进行4柱串联,可以从RNA酶解液中分离得到5′-尿苷酸,而不混有其它核苷酸,并对离子交换树脂种类、树脂量、洗脱剂等作了进一步研究。结果表明,采用4柱串联分离5′-尿苷酸,其总收率达到92.1%、结晶纯度达到86%以上。

乙醇-水混合溶剂中尿苷酸浓度与溶液密度的关系

获取尿苷酸溶析结晶动力学参数须测定其溶液浓度变化,针对密度法浓度在线测量技术,研究了乙醇 水混合溶剂中尿苷酸(Uridine 5' monophosphate)质量浓度与溶液密度的关系。20℃条件下,测定了尿苷酸在不同质量分数乙醇 水混合溶剂中的溶解度和溶液密度,以及混合溶剂质量分数一定时的尿苷酸质量浓度和溶液密度。实验结果表明:乙醇 水混合溶剂中,溶液体积与尿苷酸质量浓度具有较高的相关性,可以拟合得到三元溶液体系尿苷酸质量浓度与溶液密度的变化关系式。

利用重组嗜热栖热菌尿苷-胞苷激酶生产尿苷酸

尿苷-胞苷激酶(Uridine/cytidine kinase,UCK)作为生物体核苷酸代谢补偿途径中的重要催化剂,可以催化尿苷和胞苷磷酸化成为尿苷酸(5'-uridine monophosphate,5'-UMP)和胞苷酸(5'-cytidine monophosphate,5'-CMP)。利用大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)分别成功克隆表达了来源于嗜热栖热菌(Thermus thermophilus HB8)以及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)的尿苷-胞苷激酶。对比分析了不同重组尿苷-胞苷激酶的催化特性发现,来源于嗜热栖热菌的尿苷-胞苷激酶能以鸟苷三磷酸(Guanosine 5'-triphosphate,GTP)或者腺苷三磷酸(Adenosine 5'-triphosphate,ATP)作为磷酸供体催化尿苷生成尿苷酸,而来源于枯草芽孢杆菌的尿苷-胞苷激酶只有以GTP作为磷酸供体时的催化效果较好。在优化的反应条件下,使用来源于嗜热栖热菌的尿苷-胞苷激酶,6 h可催化10 mmol/L的尿苷和10 mmol/L的ATP生成8.74 mmol/L尿苷酸。研究结果表明,以ATP作为磷酸供体的尿苷-胞苷激酶可作为一种新型的催化剂用于尿苷酸的研制与生产。

酿酒酵母工程菌分批发酵产UMP动力学模型

对酿酒酵母工程菌产UMP的分批发酵动力学进行了研究。通过对Logistic方程、Leudeking-Piret方程和类Luedeking-Piret方程进行参数估计和非线性数据拟合,分别得到发酵过程中菌体干重、UMP产量、残糖含量动力学模型及模型参数。对拟合曲线进行分析,结果表明模型值与实验值拟合性良好,线性拟合度大于98%,所建立模型能较好的反映UMP的分批发酵过程。

固定化尿苷-胞苷激酶和聚磷酸激酶偶联催化制备5′-胞苷酸

尿苷-胞苷激酶作为生物体核苷酸代谢补偿途径中的重要催化剂,可以催化胞苷的磷酸化反应合成5′-胞苷酸(简称胞苷酸),但需要NTP作为磷酸供体。为了提高胞苷酸的生产效率,文中首先使用大肠杆菌分别异源表达来源于嗜热栖热菌Thermus thermophiles HB8的尿苷-胞苷激酶和来源于类球红细菌Rhodobacter sphaeroides的聚磷酸激酶,其中尿苷-胞苷激酶用于催化胞苷和ATP形成胞苷酸,聚磷酸激酶则用于ATP的循环再生。然后,使用D403金属螯合树脂吸附Ni^2+形成固定化载体,再利用固定化载体特异性吸附重组酶形成固定化酶。最后,单因素优化实验确定固定化酶的催化反应条件,在30℃、pH 8.0的条件下,以60 mmol/L胞苷和0.5 mmol/L ATP为底物,可实现5批次的高效连续催化反应,胞苷酸平均摩尔得率达到91.2%。上述制备方法反应成本低,产物得率高,酶利用率高,在工业生产中具有较好的应用潜力。

酿酒酵母中过表达URA 5及URA 3基因催化合成UMP的初步研究

为提高乳清酸到尿嘧啶核苷酸(UMP)的转化效率,利用PCR方法扩增酿酒酵母乳清酸磷酸核糖转移酶基因URA5,并将其连接到携带乳清苷酸脱羧酶基因URA3的表达载体pYX212中,构建了重组质粒pYX212-URA5,然后转化到酿酒酵母BJX12中进行表达,并进行转化乳清酸到UMP的初步研究。试验结果表明:pYX212-URA5/BJX12发酵培养40h后以32mmol/L乳清酸为底物催化产生UMP的量约为7mmol/L。明显高于同等条件下pYX212/BJX12的UMP产量2.7mmol/L和对照组野生型BJX12的UMP产量2.4mmol/L。

HPLC同时测定百令胶囊中5种核苷类成分的含量

目的：建立HPLC同时测定百令胶囊中5种核苷类成分尿苷酸、尿苷、腺苷酸、鸟苷和腺苷含量的方法。方法：采用Ultimate AQ C18色谱柱（4.6 mm×250 mm,5μm）,以甲醇-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾溶液为流动相进行梯度洗脱,流速1.0m L·min-1,检测波260 nm,柱温25℃。结果：在该色谱条件下,尿苷酸、尿苷、腺苷酸、鸟苷和腺苷分离良好,且分别在35.25-528.8（r=1.000）,38.07-571.1（r=1.000）,34.96-524.5（r=0.999 8）,38.34-575.1（r=1.000）,39.84-597.6 ng（r=1.000）线性关系良好。加样回收率分别为101.2%,103.1%,96.7%,101.4%,103.2%,RSD分别为1.9%,1.1%,1.3%,2.7%,1.6%。结论：该HPLC含量测定方法结果准确、可靠,具有良好的专属性、精密度、重复性和稳定性,可用于百令胶囊的质量控制。