米曲霉RIB40高效同源重组和尿苷/尿嘧啶营养缺陷型菌株的构建

目的:以米曲霉RIB40为出发菌株,构建具有高同源重组效率的营养缺陷型菌株。方法:首先通过同源重组技术和5-氟乳清酸(5-Fluoroorotic Acid,5-FOA)对尿苷/尿嘧啶营养缺陷的筛选作用,获得AopyrG基因缺失的米曲霉RIB40。然后利用烟曲霉AfpyrG基因替换Aoku70得到ΔAoku70敲除菌株,再通过5-FOA的筛选作用使得ΔAoku70菌株基因组发生自身环化,丢失AfpyrG基因。最后为了检验ΔAoku70ΔAopyrG菌株的可用性,将编码红色荧光蛋白的mCherry基因敲入至双突变菌株的组蛋白H2B基因上,并通过激光共聚焦显微镜观察红色荧光蛋白质的亚细胞定位。结果:通过AopyrG和Aoku70的双基因敲除,获得了高同源重组效率的营养缺陷型菌株ΔAoku70ΔAopyrG。用激光共聚焦观察到红色荧光蛋白定位于细胞核,表明ΔAoku70ΔAopyrG菌株可用于米曲霉的基因改造。结论:ΔAoku70ΔAopyrG菌株可作为一个高同源重组效率的营养缺陷型出发菌株用于今后米曲霉RIB40的遗传改良。

HPLC法同时测定美洲大蠊标准汤剂中6种成分含量

目的:建立HPLC法同时测定美洲大蠊标准汤剂中尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、原儿茶酸的含有量。方法:采用WATERS Symmetry Shield C 18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);甲醇-0.1%磷酸水作为流动相,梯度洗脱;体积流量0.6 mL/min;检测波长254 nm;柱温20℃。结果:测定显示尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、原儿茶酸分别在0.041~0.341μg(r=0.9994)、0.097~0.810μg(r=0.9994)、0.020~0.168μg(r=0.9999)、0.277~2.308μg(r=0.9999)、0.016~0.135μg(r=0.9997)、0.131~1.096μg(r=0.9998)范围内线性关系良好,平均加样回收率分别为99.93%(RSD=1.18%)、98.03%(RSD=1.05%)、97.17%(RSD=1.29%)、100.19%(RSD=1.91%)、98.94%(RSD=1.11%)、100.70%(RSD=1.05%)。十批美洲大蠊标准汤剂各成分含量范围分别为:尿嘧啶0.14~0.21 mg/g、次黄嘌呤0.22~0.36 mg/g、尿苷0.06~0.08 mg/g、肌苷2.17~3.15 mg/g、鸟苷0.03~0.07 mg/g、原儿茶酸0.35~0.56 mg/g,处于均值的±30%范围内。结论:美洲大蠊标准汤剂含量测定方法准确、可靠,可用于美洲大蠊配方颗粒的质量参考。

HPLC法测定10种动物药中尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、脲苷的含量

目的：对１０种动物药中的尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、脲苷进行了含量测定，以对动物药中的水溶性成分做进一步研究。方法：我们采用ＨＰＬＣ法测定了这１０种动物药中４种化合物的含量。色谱柱为ＳｈｉｍｐａｃｋＣＬＣＯＤＳ柱；流动相：０．０５ｍｏｌ／Ｌ的磷酸氢二铵溶液；流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ；检测波长：２５４ｎｍ。结果：相关系数：ｒ＝０．９９９３～０．９９９８；回收率：９８．３％～１００．５％。结论：各动物药中这几种化合物的含量和ＨＰＬＣ图谱差异较大。

不同品种灵芝中四种核苷类成分的含量比较

采用Dikma C18(250mm×4.6mm,5μm),以10mmol/mL KH2PO4水溶液(pH 4.4)-甲醇为流动相梯度洗脱(流速∶1mL/min)在260nm波长、柱温25℃条件下用HPLC考察尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤以及鸟苷在不同品种灵芝中的含量差异。结果表明,不同品种的灵芝中四种核苷类成分的含量存在显著差异,而且这种方法简便快速,稳定性和重复性良好,适用于灵芝中尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤以及鸟苷含量的同时测定。

HPLC法测定不同产地地龙中尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷的含量

目的:测定不同产地、品种的地龙药材中尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷的含量,建立地龙质量控制的客观指标。方法:用0.9%生理盐水超声提取地龙药材,采用反相高效液相色谱法,Waters Symmetry C_(18)色谱柱(150mm×4.6mm,5μm),以0.01mol·L^(-1)磷酸二氢钾溶液和50%甲醇为流动相,流速为0.8ml·min^(-1),梯度洗脱,检测波长254nm,柱温27℃,同时测定尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷等4种成分的含量。结果:尿嘧啶的线性范围为0.75～24.00μg·ml^(-1)(r=0.9993),平均回收率99.82%,RSD=2.34%(n=6);次黄嘌呤的线性范围2.50～80.00μg·ml^(-1)(r=0.9992),平均回收率101.93%,RSD=1.45%(n=6);尿苷的线性范围1.25～40.00μg·ml^(-1)(r=0.9992),平均回收率97.53%,RSD=1.73%(n=6);肌苷的线性范围5.00～160.00μg·ml^(-1)(r=0.9991),平均回收率102.06%,RSD=2.44%(n=6)。结论:该方法重复性,回收率好,可用于地龙药材中尿嘧啶等4种成分的含量测定。

HPLC法测定各沪产地龙和广地龙中次黄嘌呤、黄嘌呤、尿嘧啶和尿苷的含量

目的测定各种沪产地龙与广地龙中次黄嘌呤、黄嘌呤、尿嘧啶、尿苷的含量,建立地龙药材质量评价的方法。方法用0.9%生理盐水超声提取地龙,SORBAX SB-Aq色谱柱（250 mm×4.6 mm,5μm,Aglient Co.,Ltd）,流动相：5mmol/L磷酸二氢钾（pH 2.9）,流速1mL/min,检测波长254nm,柱温30℃,进样量10μL,采用HPLC法,同时测定次黄嘌呤、黄嘌呤、尿嘧啶、尿苷4种核苷类成分的含量。结果次黄嘌呤的线性范围为0.500 0-100.00μg（r=0.999 9）,平均回收率99.37%,RSD=1.36%（n=6）;黄嘌呤的线性范围为0.500 0-100.00μg（r=0.993 1）,平均回收率91.57%,RSD=1.40%（n=6）;尿嘧啶的线性范围为0.500 0-100.00μg（r=0.999 9）,平均回收率95.31%,RSD=1.64%（n=6）;尿苷的线性范围为0.500 0-100.00μg（r=0.999 9）,平均回收率100.21%,RSD=1.98%（n=6）。结论该方法重复性、回收率好,可用于测定地龙与广地龙中次黄嘌呤等4种核苷类成分的含量。

不同产地梅花鹿鹿茸药材中5种核苷类成分的含量测定及聚类分析

目的:建立同时测定梅花鹿鹿茸药材中尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷5种核苷类成分含量的方法,并比较不同产地梅花鹿鹿茸药材中上述核苷类成分含量的差异。方法:采用高效液相色谱法。色谱柱为Agilent Eclipse Plus C_(18),流动相为甲醇-0.07%冰醋酸溶液(4∶96,V/V),流速为1.0 m L/min,检测波长为254 nm,柱温为28℃,进样量为5μL。采用SPSS 19.0软件对30批不同产地梅花鹿鹿茸药材(S1~S30)进行聚类分析。结果:尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷的检测质量浓度线性范围均为0.001~0.01 mg/m L(r均为0.999 9);定量限分别为1.489 1、1.927 9、4.880 9、7.884 6、8.092 1 ng,检测限分别为0.446 7、0.578 4、1.464 3、2.365 4、2.427 7 ng;精密度、稳定性、重复性试验的RSD均小于2%;加样回收率分别为99.69%~103.65%(RSD=1.40%,n=9)、97.77%~103.26%(RSD=1.67%,n=9)、97.82%~101.81%(RSD=1.12%,n=9)、99.30%~104.82%(RSD=1.72%,n=9)、98.13%~100.20%(RSD=0.64%,n=9)。30批药材样品中尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷的含量存在差异。上述药材样品可聚为3大类,即S16~S18、S22~S30聚为一类,S8~S15、S19~S21聚为一类,S1~S7聚为一类。结论:该方法精密度、稳定性、重复性均较好,可用于同时测定梅花鹿鹿茸药材中尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷的含量;梅花鹿鹿茸药材的质量受生态环境、养殖技术等因素的影响,存在较大差异。

宁心宝胶囊中5种核苷类成分的RP-HPLC定量分析

目的:测定与分析宁心宝胶囊中5种核苷类成分的含量。方法:采用 RP-HPLC 法,色谱条件:Lichrospher C_(18)(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱;流动相为甲醇-0.05 mol·L^(-1)磷酸二氢钾溶液(8:92),流速为1.0 mL·min^(-1);检测波长为260 nm;柱温:25℃。结果:尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤、鸟苷和腺苷5个成分进样量分别在0.008～0.128μg,0.126～1.900μg,0.008～0.119μg,0.043～0.649μg,0.080～1.212μg范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.9998～1.000,平均回收率(n=9)为95.0%～103.8%;RSD 均小于3.0%。结果:利用建立的 RP-HPLC 方法,测定26个企业生产的68批宁心宝胶囊中尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤、鸟苷和腺苷的含量分别为0.01～0.03,0.95～2.15,0.01～0.05,0.61～1.57,0.63～1.57 mg·粒^(-1)。结论:本法灵敏度高,重复性好,提取方法与色谱条件均较简单,能有效鉴别并测定宁心宝胶囊中5种主要核苷类成分的含量。

HPLC法测定蕲蛇中核苷类成分的研究

[目的]探讨高效液相色谱法(HPLC)法测定蕲蛇药材中尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤和尿苷的分析方法。[方法]采用HPLC法,色谱条件为Dionex C18(3μm,150 mm×4.6 mm),以0.05 mol.L-1磷酸氢二钾水溶液为流动相;检测波长为254 nm;流速为0.8 mL.min-1。[结果]尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤和尿苷分别在0.0088～0.220μg、0.0352～0.880μg、0.0344～0.860μg、0.0176～0.440μg范围内具有良好线性关系;平均加样回收率分别为99.0%、98.6%、100.4%、103.0%;RSD分别为2.69%、2.25%、2.90%、2.88%。[结论]HPLC法可以测定蕲蛇药材中尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤和尿苷含量,从而控制蕲蛇药材品质。

嘧啶核苷类物质乳清酸产生菌的选育

以谷氨酸棒杆菌JSIM 2 0 1菌株为出发菌株 ,通过紫外线和甲基磺酸乙酯诱变处理 ,得到了一株尿嘧啶营养缺陷型突变体U 12菌株 ,能以葡萄糖为碳源 ,硫酸铵为氮源 ,在发酵液中积累一种紫外吸收物质。对U 12菌株的发酵液分离提取结晶 ,经物理、化学分析鉴定 ,证明是乳清酸物质。发酵液中积累乳清酸 8.6g L。

微生物发酵法生产乳清酸

以谷氨酸棒杆菌JSIM 201为出发菌株,通过紫外线和甲基磺酸乙酯诱变处理,得到了一株尿嘧啶营养缺陷型突变体U 12菌株,它能以葡萄糖为碳源,硫酸铵为氮源,在发酵液中积累一种紫外吸收物质.该紫外吸收物质经物理、化学分析鉴定,证明是乳清酸.对U 12菌株进行了发酵条件优化研究,在最佳发酵工艺条件下,积累乳清酸最高达到8.6g/L.

高效液相色谱法测定炒土鳖虫中尿嘧啶和尿苷含量

目的:建立炒土鳖虫中有效成分尿嘧啶和尿苷的高效液相色谱测定方法。方法:采用Agilent ZORBAX NH2(4.6 mm×250 mm,5μm),以乙腈-水(95∶5)作为流动相,流速为1.0 mL/min,温度40℃,紫外检测器,检测波长为205 nm。结果:高效液相色谱法(HPLC)检测炒土鳖虫尿嘧啶和尿苷在0.50~10.0μg/mL(r=0.9999)范围内呈良好的线性关系,尿嘧啶平均回收率为98.56%(RSD=1.0%,n=6),尿苷平均回收率为98.06%(RSD=0.8%,n=6)。结论:HPLC测定炒土鳖虫中的有效成分尿嘧啶和尿苷,其操作方法简单快速,结果准确可靠,是一种有效测定含量的方法。

UPLC-MS/MS同时测定山药饮片中6个核苷类成分的含量

目的建立超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法(UPLC-MS/MS)同时测定山药饮片中腺嘌呤、尿嘧啶、尿苷、腺苷、肌苷、鸟苷6个核苷的含量,比较不同规格山药饮片中核苷类成分含量。方法采用ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7μm)色谱柱,以0.1%甲酸溶液-甲醇为流动相梯度洗脱,流速0.35 mL·min^-1,柱温30℃,正离子模式下多反应监测测定。结果6个核苷类成分在对应线性范围与峰面积具有良好的线性关系(R2≥0.9987),方法精密度、重复性和稳定性的RSD值均小于3.0%,平均加样回收率在97.9%~100.4%,RSD在0.98%~2.4%。不同规格山药饮片中6个核苷类成分含量有差异,山药片的核苷类成分含量显著高于山药及麸炒山药。结论该方法适用于同时测定山药饮片中6个核苷类成分含量,可用于山药饮片的质量控制。建议采用趁鲜切制等新技术加工山药,提高山药的质量。

米曲霉3.042尿苷/尿嘧啶营养缺陷型遗传转化体系的构建

米曲霉对潮霉素等多种抗生素不敏感,对其基因改造有一定困难。该研究以米曲霉3.042为出发菌株,建立pyrG筛选标记遗传转化体系。首先,分别运用紫外诱变法和左右臂同源重组法破坏米曲霉自身的pyrG基因,在含有5-氟乳清酸和尿苷/尿嘧啶的培养基平板进行筛选,最终两种方法分别获得性状稳定的尿苷/尿嘧啶营养缺陷型突变株米曲霉O11和米曲霉g-1。随后以缺陷型突变株为出发菌株,利用农杆菌转化法转入包含pyrG回补标记的质粒,其中米曲霉g-1突变株获得原养型的回补菌株,紫外诱变法获得的缺陷型突变菌株米曲霉O11未能恢复为原养型。研究表明米曲霉3.042 pyrG基因大片段缺失的缺陷型菌株,可直接以自身pyrG基因作为选择标记进行遗传改造。

RP-HPLC测定冻干鹿茸中的尿嘧啶和尿苷

本文采用正交实验设计法对超声辅助提取的实验条件(试剂浓度、试剂体积、超声时间、超声温度)进行了优化,建立反相高效液相色谱测定冻干鹿茸中尿嘧啶,尿苷含量的方法。结果表明,1.000 g冻干鹿茸样品用40 mL 50%乙醇,60℃提取50 min时,提取效果最佳。采用反相高效液相色谱进行测定,尿嘧啶和尿苷在1.0mg/L～30 mg/L浓度范围内,其峰面积与浓度均具有良好的线性关系,加标回收率91.8%～102.9%。该方法可快速、准确测定鲜鹿茸经冷冻干燥处理后样品中尿嘧啶和尿苷的含量。

宁心宝胶囊指纹图谱研究及4种核苷类成分的含量测定

目的:研究宁心宝胶囊的HPLC指纹图谱,并建立同时测定宁心宝胶囊中尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤、腺苷含量的方法。方法:采用Agilent Zorbax SB-Aq C_(18)色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),甲醇-0.05 mol·L^(-1)磷酸二氢钾水溶液为流动相,梯度洗脱,流速为1.0 ml·min^(-1),检测波长为212 nm(指纹图谱)、260 nm(含量测定),柱温为30℃。对10批宁心宝胶囊进行了指纹图谱及含量测定研究,采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件进行分析。结果:建立了宁心宝胶囊的HPLC指纹图谱,标定了10个共有色谱峰。4种核苷类成分的分离度良好。结论:此方法简便、可靠,指纹图谱结合含量测定可以更好地控制宁心宝胶囊的内在质量。

一测多评法测定水蛭中尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤和尿苷的含量

目的:建立同时测定水蛭药材中尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤和尿苷4个成分含量的方法。方法:采用高效液相色谱法,色谱柱为ZORBAXSB-C18(4.6mm×250mm,5μm),流动相为乙腈-10mmol·L-1磷酸二氢钾溶液(梯度洗脱),流速为1.0mL·min^-1,检测波长为254nm,柱温为30℃,进样量为10μL。以次黄嘌呤为内参物,计算其对尿嘧啶、黄嘌呤和尿苷的相对校正因子(RCF),通过RCF计算上述3个成分的含量;以外标法测定的含量作实测值,比较计算值与实测值的差异。结果:尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤和尿苷检测质量浓度线性范围分别为1.60~32.00、4.05~81.00、1.50~30.00、1.25~25.00μg·mL-1(r>0.999);精密度、稳定性、重复性试验的RSD<2.0%;平均加样回收率(n=6)分别为95.05%~99.45%(RSD=1.73%、95.89%~99.38%(RSD=1.52%、94.00%~97.88%(RSD=1.74%、96.07%~99.35%(RSD=1.18%)。计算值与实测值差异无统计学意义(P>0.05)。结论:该方法操作简便,精密度、稳定性、重复性良好,可用于水蛭药材中尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤和尿苷4个成分含量的同时测定。

双标记尿嘧啶核苷-(^(13)C,^(15)N_2)的合成研究

设计了以无水苯为溶剂,双标记尿素-(^(13)C,^(15)N_2)和丙炔酸为原料进行环化反应,粗品经脱色和重结晶后得到双标记尿嘧啶-(^(13)C,^(15)N_2)。在Ar气氛下,双标记尿嘧啶-(^(13)C,^(15)N_2)和1-乙酰氧基-2,3,5-三苯甲酰氧基-β-D-呋喃核糖反应,经处理后得到的中间体1-(2,3,5-三苯甲酰氧基-β-D-呋喃核糖基)尿嘧啶-(^(13)C,^(15)N_2)用氨水水解,即可得到双标记尿嘧啶核苷-(^(13)C,^(15)N_2)。该方法操作简单,中间体只需简单纯化,各步反应收率高,并且^(13)C、^(15)N同位素丰度不被稀释。产物经高效液相色谱法(HPLC)、MS、~1H NMR和^(13)C NMR表征,结果表明,双标记尿嘧啶核苷-(^(13)C,^(15)N_2)质量分数>98%,^(15)N同位素丰度>98%,^(13)C同位素丰度>98%。

HPLC法测定沪地龙中7个核苷类成分的含量

目的:建立中药材沪地龙中7个核苷类成分的分析方法。方法:采用0.1%氨水超声提取沪地龙药材中尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、2’-脱氧鸟苷,并应用反相高效液相色谱法测定其含量;色谱条件:采用Gemini C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以5 mmol·L^(-1)乙酸铵溶液和甲醇为流动相,梯度洗脱,流速为1.0 mL·min^(-1),检测波长254 nm,柱温30℃。结果:尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷和2’-脱氧鸟苷的线性范围分别为0.51~102.09μg·mL^(-1)(r=1.000 0),0.52~103.78μg·mL^(-1)(r=1.000 0),0.50~101.03μg·mL^(-1)(r=1.000 0),0.52~104.79μg·mL^(-1)(r=1.000 0),0.50~99.99μg·mL^(-1)(r=1.000 0),0.55~110.54μg·mL^(-1)(r=1.000 0),0.50~99.28μg·mL^(-1)(r=1.000 0);平均回收率(n=6)分别为98.6%(RSD=2.6%)、104.6%(RSD=1.8%)、105.3%(RSD=1.4%)、96.2%(RSD=2.6%)、91.0%(RSD=0.42%)、88.1%(RSD=2.1%)和106.5%(RSD=2.1%)。12批样品中上述7个核苷类成分的含量测定结果分别为0.046~0.864、0.263~0.770、0.034~0.631、0.379~0.994、1.655~3.595、0.544~1.465和0.074~0.208 mg·g^(-1)。结论:该方法可用于沪地龙药材中核苷类成分的含量测定。

RP-HPLC同时测定暗紫贝母中10个核苷及碱基类成分的含量

目的:建立RP-HPLC-DAD同时测定暗紫贝母药材中5个核苷类活性成分(尿苷、鸟苷、胸苷、腺苷、肌苷)及5个游离的碱基(腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶)含量的方法。方法:采用Agilent Zorbax Bonus-RP C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相为甲醇和水,梯度洗脱,流速1 mL·min-1;检测波长260 nm;柱温30℃。结果:胞嘧啶、尿苷、鸟苷、胸苷、腺苷、腺嘌呤、肌苷、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶的质量浓度分别在1.78～56.80 mg·L-1、1.84～59.00 mg·L-1、1.58～50.60 mg·L-1、1.73～55.30 mg·L-1、1.78～57.10 mg·L-1、1.63～52.10 mg·L-1、1.79～57.20 mg·L-1、1.80～57.70 mg·L-1、1.63～52.30 mg·L-1、1.63～52.30 mg·L-1范围内与峰面积呈良好线性关系,平均回收率为97.7%～103.2%,RSD≤2.2%。结论:建立了RP-HPLC-DAD同时测定暗紫贝母药材中10个核苷及碱基类成分含量的方法,该方法简单,重复性好,准确可靠;暗紫贝母药材中鸟苷、尿苷、胸苷、腺苷含量较高;青海久治、大通产暗紫贝母药材中核苷含量均高于四川松潘;青海2个产地比较,大通产暗紫贝母药材中核苷含量又明显高于久治。