Calpastatin participates in the regulation of cell migration in BAP1-deficient uveal melanoma cells

AIM: To detect how BRCA-associated protein 1(BAP1) regulates cell migration in uveal melanoma(UM) cells. METHODS: Wound healing and transwell assays were performed to detect UM cell migration abilities. Protein chip, immunoprecipitations and surface plasmon resonance analyses were applied to identify BAP1 protein partners. Western blot and calpain activity assays were used to test the expression and function of calpastatin(CAST). RESULTS: CAST protein was confirmed as a new BAP1 protein partner, and loss of BAP1 reduced the expression and function of CAST in UM cells. The overexpression of CAST rescued the cell migration phenotype caused by BAP1 loss.CONCLUSION: BAP1 interacts with CAST in UM cells, and CAST and its subsequent calpain pathway may mediate BAP1-related cell migration regulation.

Immune oppression array elucidating immune escape and survival mechanisms in uveal melanoma

AIM： To examine the genetic profile of primary uveal melanoma （UM） as compared to UM in immune escape.METHODS： Dendritic cells （DC） loaded with lysates of UM cells of high metastatic potential were used to stimulate CTLs（CTLs）. When CTLs co-cultured with the UM cells, most UM cells could be eliminated. Survival UM cells grew slowly and were considered to be survival variants and examined by a microarray analysis. These differential genes were analyzed further with Venn Diagrams and functions related to immune escape. We additionally examined transcriptional changes of manually selected survival variants of UM cells and of clinical UM samples by quantitative real-time polymerase chain reaction （qRT-PCR）, and analyzed the correlation of these expressions and patients’ survival.RESULTS： Gene expression analyses revealed a marked up-regulation of SLAMF7 and CCL22 and a significant down-regulation of KRT10, FXYD3 and ABCC2. The expression of these genes in the relapsed UM was significantly greater than those in primary UM. UM patients with overexpression of these genes had a shorter survival period as compared with those of their underexpression.CONCLUSION： Gene expression, in particular of SLAMF7, CCL22, KRT10, FXYD3 and ABCC2, differed between primary UM cells and survival variants of UM cells.

miR-506-3p通过靶向结合SART3抑制葡萄膜黑色素瘤恶性表型

目的:探讨miR-506-3p通过靶向结合鳞状细胞癌抗原3(squamous cell carcinoma antigen 3,SART3)抑制葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma,UM)恶性表型的机制。方法:实验将OCM-1A和MUM-213细胞构建miR-506-3p过表达模型(miR-NC组和miR-506-3p组),构建SART3敲低模型(shNC组、shSART31#组和shSART32#组)。生物信息学分析miR-506-3p和SART3与UM不良表型之间的关系并预测两者之间的靶向关系。RT-PCR检测miR-506-3p和SART3在APRE-19、OCM-1A和MUM-213细胞中的表达。CCK-8实验、细胞划痕愈合实验和侵袭实验分别检测细胞增殖、横向迁移和侵袭能力。裸鼠成瘤实验检测瘤体重量、体积。Western Blot实验检测SART3蛋白表达。双荧光酶素实验验证miR-506-3p和SART3的靶标关系。结果:miR-506-3p在UM细胞中低表达,过表达miR-506-3p能抑制细胞增殖、迁移和侵袭能力。上调miR-506-3p表达可以抑制裸鼠移植瘤生长。数据库预测SART3是miR-506-3p的靶基因,双荧光酶素报告实验证实SART3是miR-506-3p作用靶点。SART3在UM中高表达,下调SART3表达可以抑制UM细胞增殖、迁移和侵袭。miR-506-3p靶向结合SART3抑制UM细胞增殖、迁移和侵袭。结论:miR-506-3p能抑制UM细胞增殖、迁移和侵袭,其作用机制可能是通过下调SART3表达实现的。

蛋白酶活化受体2在葡萄膜黑色素瘤中的表达及对细胞增殖和侵袭的影响

目的:探讨蛋白酶活化受体2(protease-activated receptor 2,PAR2)在葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma,UM)中的表达,以及沉默人UM细胞系M23中PAR2基因对细胞增殖和侵袭的影响。方法:选取2012-02/2017-12在我院行手术治疗且资料完整的UM患者45例45眼,选取同期因眼部外伤行眼球摘除且葡萄膜正常的患者30例30眼,实时荧光定量PCR术检测UM和正常脉络膜组织中PAR2基因表达,培养M23细胞并分为PAR2干扰组、阴性对照序列组和空白组,实时荧光定量PCR技术检测细胞中PAR2基因表达,MTT法检测细胞增殖能力,Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力。结果:UM组织中PAR2 mRNA相对表达量为1. 73±0. 13,正常脉络膜组织中PAR2 mRNA相对表达量为1. 06±0. 10,差异有统计学意义(t=23. 732,P <0. 01); UM组织中PAR2 mRNA相对表达量与病理学类型、巩膜浸润、视盘受累和眼外生长有关,差异有统计学意义(P<0. 05);PAR2干扰组细胞中PAR2 mRNA相对表达量低于阴性对照序列和空白组,差异有统计学意义(P<0. 05); PAR2干扰组细胞24、48、72和96h时吸光度A值低于阴性对照组和空白组,差异有统计学意义(P<0. 05); PAR2干扰组迁移细胞数和侵袭细胞数低于阴性对照序列组和空白组(P<0. 05)。结论:PAR2在UM组织中呈高表达,且与肿瘤高转移风险有关,特异性沉默M23细胞中PAR2基因表达可有效抑制细胞增殖、迁移及侵袭。

葡萄膜黑色素瘤对化疗药物的敏感性及影响机制的研究

目的研究探讨葡萄膜黑色素瘤体外化疗对6种药物的敏感性及其影响机制。方法葡萄膜黑色素瘤体外原代与传代培养,抗HMB45免疫组织化学估计肿瘤细胞纯度,MTT法检测对5-氟脲嘧啶、顺铂、噻替哌、阿霉素、长春新碱和足叶乙甙6种化疗药物的敏感性,蛋白印迹法检测耐药基因bcl-2和LRP的表达,分析其表达程度与耐药性的关系。结果体外药敏试验显示6种化疗药物临床常规剂量,对肿瘤细胞的抑制率均不能达到50%,蛋白印迹结果显示bcl-2在体外培养的肿瘤细胞中均有较高表达,而LRP表达在不同类型的肿瘤细胞中不同,表达的高低与耐药程度呈正相关。结论葡萄膜黑色素瘤体外对临床常用6种化疗药物具有较高耐受性,LRP和bcl-2均与其天然耐药性有关,LRP可能起主要作用。

葡萄膜黑色素瘤术后自体细胞因子诱导的杀伤细胞治疗效果观察

目的探讨葡萄膜黑色素瘤术后自体细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cell,CIK)治疗的效果。方法对我院2005年1月至2009年1月收治的38例葡萄膜黑色素瘤术后患者进行分析,18例患者未进行抗肿瘤治疗,设为对照组;20例患者进行自体CIK治疗,设为CIK治疗组。观察2组1a、3a内复发率及3a内生存率,并观察CIK治疗组治疗前及治疗3个月后患者外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD16+、CD56+细胞情况。结果对照组患者1a内复发3例(16.67%),3a内复发9例(50.00%),3a内生存14例(77.78%);CIK治疗组1a内复发2例(10.00%),3a内复发6例(30.00%),3a内生存18例(90.00%)。2组间1a内复发率比较,差异无统计学意义(P>0.05);3a内复发率与生存率比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。CIK治疗3个月后,患者外周血中T细胞(CD3+、CD4+、CD8+)和NK细胞(CD16+、CD56+)均显著上升,与治疗前比较,差异均有统计学意义(P<0.05或0.01)。结论葡萄膜黑色素瘤术后自体CIK治疗可获得较好的疗效。

长链非编码RNA(lncRNA)核仁小RNA宿主基因7(SNHG7)对葡萄膜黑色素瘤癌细胞增殖和侵袭力的影响

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)核仁小RNA宿主基因7(SNHG7)对葡萄膜黑色素瘤癌细胞增殖和侵袭力的影响。方法选取2011年8月至2019年8月在我院行手术治疗的葡萄膜黑色素瘤患者71例71眼作为葡萄膜黑色素瘤组,另选取因外伤摘除且葡萄膜完整、眼球正常的患者40例40眼作为正常组。两组患者性别、年龄、患眼眼别差异均无统计学意义(均为P>0.05)。采用实时荧光定量PCR检测两组患者眼球组织中SNHG7表达。取M23细胞进行培养,将对数生长期细胞分成3组,SNHG7干扰组转染SNHG7干扰序列;阴性对照组转染阴性对照序列;空白组不作任何处理。采用实时荧光定量PCR检测各组细胞中SNHG7表达,CCK-8法检测转染后细胞增殖活性,Transwell法检测细胞侵袭力。结果葡萄膜黑色素瘤组患者眼球组织中SNHG7的相对表达量为2.05±0.16,正常组患者眼球组织中SNHG7的相对表达量为1.01±0.07,两组差异有统计学意义(t=39.461,P<0.001)。葡萄膜黑色素瘤组在发生巩膜浸润和眼外生长的患者眼球组织中SNHG7相对表达量均较无巩膜浸润和无眼外生长的患者高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。转染后继续培养48 h,SNHG7干扰组细胞SNHG7相对表达量(0.27±0.09)明显低于阴性对照组(1.01±0.07)和空白组(1.03±0.09)(均为P<0.001)。与阴性对照组和空白组相比,SNHG7干扰组细胞转染后24 h、48 h、72 h和96 h时光密度均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。转染后48 h,SNHG7干扰组侵袭细胞数(89.77±9.82)个显著低于阴性对照组(133.14±7.54)个和空白组(137.09±10.05)个(均为P<0.001)。结论葡萄膜黑色素瘤患者眼球组织中SNHG7呈高表达,且SNHG7高表达与肿瘤组织巩膜浸润和眼外生长有关,下调SNHG7基因表达可阻碍M23细胞增殖和侵袭。

小干扰RNA沉默HIF-1α对缺氧状态下脉络膜黑色素瘤细胞中MMP-2表达的影响

目的:以小干扰RNA沉默人眼脉络膜黑色素瘤细胞中的低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)基因,在缺氧状态下观察其对人眼脉络膜黑色素瘤(human uveal melanoma cell,OCM-1)细胞中基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)基因表达的影响。方法:将脉络膜黑色素瘤细胞分为正常组与缺氧组,其中将缺氧组再分成单纯缺氧组、干扰组、脂质体对照组、阳性对照组和阴性对照组;对正常组细胞用含有浓度为10%的胎牛血清和1%的双抗(青-链霉素混合液)的DMEM高糖培养基进行培养。在缺氧组人眼OCM-1细胞的培养瓶中加入100μmol/L CoC l2以构建肿瘤细胞内部的缺氧微环境。干扰组转染HIF-1αsiRNA,阴性对照组转染无义siRNA,阳性对照组转染β-actin siRNA,脂质体对照组转染空脂质体。RT-PCR检测细胞中HIF-1α和MMP-2 mRNA的表达,行Western-blot检测HIF-1α和MMP-2蛋白的表达。结果:与正常组相比,单纯缺氧组HIF-1α蛋白的表达增高(P<0.05),而其mRNA表达量无明显变化(P>0.05);MMP-2 mRNA及蛋白的表达升高(P<0.05)。缺氧培养的各组之间相比,阳性对照组β-actin mRNA表达下降(P<0.05),证实转染成功;干扰组HIF-1αmRNA和MMP-2mRNA和蛋白表达均下降(P<0.05),阴性对照组、脂质体对照组各检测因素均无明显差别(P>0.05)。结论:缺氧条件下可以提高人眼脉络膜黑色素瘤细胞中HIF-1α蛋白的表达,而且HIF-1α蛋白的表达水平可以影响MMP-2的转录与翻译,从而可能进一步影响人眼脉络膜瘤细胞的外周浸润和远处转移能力。

马钱子碱诱导人葡萄膜黑色素瘤细胞凋亡影响及作用机制研究

目的观察马钱子碱对人葡萄膜黑色素瘤细胞凋亡的影响及作用机制。方法将体外培养的人葡萄膜黑色素瘤细胞分为4组:对照组(CG)、马钱子碱低(BLG)、中(BMG)、高浓度组(BHG),CCK-8法测定细胞增殖率,苏木精-伊红(HE)染色法观察马钱子碱对黑色素瘤细胞形态的影响,Hoechst 33258核染色法观察细胞核凋亡,Annexin V/PI染色检测细胞凋亡率,Western blot法检测黑色素瘤细胞内Bax及Bcl-2蛋白表达。结果(1)细胞增殖率:与CG组比较,BLG组、BMG组及BHG组细胞增殖率均下降,差异有统计学意义(tBLG=7.964,P_(BLG)=0.000;t_(BMG)=12.920,PBMG=0.000;t_(BHG)=20.962,P_(BHG)=0.000);与BLG组比较,BHG组差异有统计学意义(t=10.720,P=0.000);与BMG组比较,BHG组差异有统计学意义(t=6.291,P=0.000)。(2)细胞凋亡率:与CG组比较,BLG组、BMG组及BHG组细胞凋亡率逐渐增加,差异有统计学意义(t_(BLG)=7.982,P_(BLG)=0.000;tBMG=12.744,P_(BMG)=0.000;t_(BHG)=15.960,P_(BHG)=0.000);与BLG组比较,BHG组差异有统计学意义(t=6.940,P=0.000)。(3)Bax蛋白表达:与CG组比较,各组间差异有统计学意义(t_(BLG)=4.082,P_(BLG)=0.004;t_(BMG)=16.740,P_(BMG)=0.000;t_(BHG)=28.990,PBHG=0.000)。与BLG组比较,BMG组差异有统计学意义(t=12.660,P=0.000),BHG组差异有统计学意义(t=23.680,P=0.000)。与BMG组比较,BHG组差异有统计学意义(t=11.020,P=0.000)。(4)Bcl-2蛋白表达:与CG组比较,各组间差异有统计学意义(t_(BLG)=6.678,P_(BLG)=0.000;tBMG=9.080,PBMG=0.000;t_(BHG)=10.079,P_(BHG)=0.000)。与BLG组比较,BMG组差异有统计学意义(t=10.340,P=0.000),BHG组差异有统计学意义(t=14.550,P=0.000)。与BMG组比较,BHG组差异有统计学意义(t=3.674,P=0.006)。结论马钱子碱通过改变线粒体凋亡途径中凋亡相关信号分子Bax及Bcl-2的表达,抑制黑色素瘤细胞增殖并促进细胞凋亡。

石蒜碱对葡萄膜黑色素瘤细胞的作用及其可能机制

目的探讨石蒜碱对葡萄膜黑色素瘤细胞的作用,并分析其可能机制。方法取B16F10葡萄膜黑色素瘤细胞株,按石蒜碱浓度为0μmol•L^(-1)(对照组)、1.560μmol•L^(-1)、3.125μmol•L^(-1)、6.250μmol•L^(-1)、12.500μmol•L^(-1)、25.000μmol•L^(-1)进行分组培养,24 h后,CCK-8法检测各组B16F10细胞的存活率;RT-PCR分析各组B16F10细胞VEGF-A mRNA的表达,ELISA检测各组B16F10细胞VEGF-A蛋白表达;流式细胞仪检测各组B16F10细胞的细胞周期及凋亡情况。结果与对照组相比,1.560μmol•L^(-1)、3.125μmol•L^(-1)、6.250μmol•L^(-1)、12.500μmol•L^(-1)、25.000μmol•L^(-1)石蒜碱作用于B16F10细胞24 h后,能够呈浓度依赖性抑制B16F10细胞生长(其半数抑制浓度为7.950μmol•L^(-1)),下调B16F10细胞中VEGF-A mRNA的表达,抑制VEGF-A蛋白分泌,其中25.000μmol•L^(-1)石蒜碱抑制效果最显著。流式细胞仪检测结果显示,1.560μmol•L^(-1)、3.125μmol•L^(-1)、6.250μmol•L^(-1)、12.500μmol•L^(-1)、25.000μmol•L^(-1)石蒜碱干预B16F10细胞24 h后,细胞凋亡率由对照组0.00%,分别上升为12.80%、12.86%、16.68%、18.54%、22.20%;G1期细胞比例由对照组(30.86±0.69)%,分别上升为(56.55±0.95)%、(60.92±0.85)%、(62.65±0.53)%、(67.55±0.92)%、(74.18±0.45)%,与对照组相比,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论石蒜碱在体外能够呈浓度依赖性抑制葡萄膜黑色素瘤细胞B16F10的VEGF水平,引发细胞S期阻滞,诱导细胞凋亡,从而显著抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖。

LncRNA MT1JP对葡萄膜黑色素瘤细胞迁移和侵袭的影响

目的研究LncRNA MT1JP对葡萄膜黑色素瘤细胞迁移和侵袭的影响及机制。方法实时荧光定量PCR测定LncRNA MT1JP在葡萄膜黑色素瘤细胞系SP6.5、M23及正常视网膜色素上皮细胞系ARPE-19中的表达,将SP6.5细胞分成3组,即MT1JP组、siMT1JP组和NC组,分别转染pcDNA3.1-MT1JP、pcDNA3.1-siMT1JP及pcDNA3.1空载体,采用细胞划痕实验和Transwell实验测定3组划痕愈合率和侵袭细胞数,Western blot测定P53蛋白表达水平。结果葡萄膜黑色素瘤细胞系SP6.5和M23中LncRNA MT1JP的相对表达量分别为0.20±0.02和0.31±0.01,均显著低于正常视网膜色素上皮细胞系ARPE-19的1.0(均为P<0.01)。siMT1JP组划痕愈合率为61.5%±3.7%,MT1JP组为10.6%±1.7%,NC组为20.0%±2.1%,3组间两两相比差异均有统计学意义(均为P<0.01)。在200倍视野下,siMT1JP组侵袭细胞数为(75.6±6.8)个,MT1JP组侵袭细胞数为(10.3±2.6)个,NC组为(29.50±3.9)个,3组间两两相比差异均有统计学意义(均为P<0.01)。siMT1JP组P53蛋白相对表达量为0.41±0.04,显著低于NC组的1.0(P<0.01);MT1JP组P53蛋白相对表达量为5.73±0.62,显著高于NC组的1.0(P<0.01)。结论 LncRNA MT1JP抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的转移和侵袭,其机制可能与上调P53蛋白表达有关。

HMGA1在葡萄膜黑色素瘤中的表达及对细胞增殖和侵袭的影响

目的:探讨高迁移率族蛋白A1(HMGA1)蛋白在葡萄膜黑色素瘤(UM)组织中的表达,以及抑制该基因表达对细胞增殖和侵袭的影响。方法:选取2014-02/2019-08在我院接受手术治疗的UM患者53例53眼,同期留取因外伤摘除眼球的正常葡萄膜组织34例34眼。采用免疫组织化学法检测组织中HMGA1蛋白表达。将体外培养的人UM细胞系M23分为HMGA1下调组、阴性对照组和空白组,分别转染HMGA1干扰序列、阴性对照序列和不作任何处理,采用实时荧光定量PCR术检测HMGA1 mRNA表达,CCK-8法检测细胞增殖能力,Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力。结果:UM组织中HMGA1蛋白阳性表达率为77%,高于正常葡萄膜组织中的29%(P<0.001);与未发生巩膜浸润、未累及睫状体和未发生眼外生长相比,HMGA1蛋白在发生巩膜浸润、累及睫状体和发生眼外生长的组织中阳性表达率升高(均P<0.05)。与阴性对照组和空白组相比,HMGA1 mRNA在HMGA1下调组细胞中相对表达量降低,且HMGA1下调组细胞培养24、48、72、96h时吸光度OD值降低,迁移细胞数和侵袭细胞数均明显减少(均P<0.05)。结论:UM组织中HMGA1蛋白阳性表达率升高,下调M23细胞中HMGA1表达可减少细胞增殖,抑制细胞迁移和侵袭。

葡萄膜黑色素瘤相关炎症浸润细胞及免疫治疗

巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞、淋巴细胞等免疫细胞,以及相关的白细胞介素-10、转化生长因子-β、干扰素-γ等细胞因子,在葡萄膜黑色素瘤中有着重要的作用机制。肿瘤细胞、免疫细胞和细胞因子之间独特的相互作用表明,免疫治疗可能是治疗葡萄膜黑色素瘤的有效方法。分析这三者之间动态关系的研究将不仅有助于理解肿瘤生长和免疫逃避的病理生理机制,而且有助于研究新的治疗方法。本文主要简述了葡萄膜黑色素瘤相关的免疫细胞、细胞因子对肿瘤细胞的作用,并回顾了常见的免疫治疗进展。

慢病毒介导星形胶质细胞活化基因-1沉默对葡萄膜黑色素瘤生物学行为的影响

目的探讨星形胶质细胞活化基因-1（AEG-1）对葡萄膜黑色素瘤（UM）生物学行为的影响。方法培养不同侵袭转移潜能的MUM-2B和MUM-2C细胞系，根据AEG-1基因序列设计出有效RNA干扰（RNAi）靶点序列及RNAi阴性对照scramble序列进行慢病毒载体的制备和病毒包装。在2株细胞系中，经AEG-1-RNAi慢病毒感染的细胞作为慢病毒感染组，空白慢病毒载体感染的细胞作为阴性对照组，未处理的细胞作为正常对照组。采用Real-time PCR、Western blot法分别检测各组细胞中AEG-1转录水平和蛋白表达水平；采用MTT法、Annexin V-APC法、细胞侵袭试验和细胞Transwell试验检测慢病毒介导AEG-1沉默对人UM细胞系生物学行为的影响。结果成功制备RNAi慢病毒载体而进行病毒包装，然后分别转染对数生长期的MUM-2B、MUM-2C细胞系，2株细胞系中的正常对照组、阴性对照组和慢病毒感染组间细胞中AEG-1 mRNA相对表达量总体比较差异均有统计学意义（F=130.02，P<0.01；F=144.17，P<0.01）。在MUM-2B细胞系中和MUM-2C细胞系中，染组较阴性对照组AEG-1 mRNA相对表达量分别下降约77.1%和79.8%，差异均有统计学意义（均P<0.01）；正常对照组与阴性对照组细胞中AEG-1 mRNA相对表达量比较，差异均无统计学意义（均P>0.05）。Western blot法检测结果显示，AEG-1蛋白表达水平在2株细胞系中的各组比较，差异均有统计学意义（F=146.17，P<0.01；F=156.79，P<0.01），其中慢病毒感染组较阴性对照组蛋白相对表达均显示下调，差异均有统计学意义（均P<0.01）。MTT法检测发现，2株细胞系实验第2～5天，慢病毒感染组细胞增生倍数较阴性对照组明显下降，差异均有统计学意义（t=5.78、30.68、23.99、29.40，均P<0.01；t=7.88、7.09、5.56、6.60，均P<0.01）；Annexin V-APC法检测发现，2株细胞系中慢病毒感染组凋亡率明显高于阴性对照组，差异均有统计学意义（t=54.34，P＜0.01；t=11.68，P＜0.01）；细胞侵袭试验发现，在2株细胞系中慢病毒感染组侵袭倍数明显低于阴性对照组，差异均有统计学意义（t=16.04，P＜0.01；t=13.98，P＜0.01）；细胞Transwell试验发现，在2株细胞系中慢病毒感染组转移倍数均明显低于阴性对照组，差异均有统计学意义（t=12.04，P＜0.01；t=22.43，P＜0.01）。结论慢病毒介导AEG-1沉默后，通过抑制UM细胞AEG-1的转录水平和蛋白表达水平，从而改变UM细胞的生物学行为，一定程度上减缓细胞增生，促进细胞凋亡并降低细胞侵袭和转移的能力。

APOBEC3B调控葡萄膜黑色素瘤复制应激的研究

目的·研究载脂蛋白B mRNA编辑酶催化亚基3B(apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic subunit 3B,APOBEC3B)在葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma,UM)中的生物学功能以及对药物治疗敏感性的影响。方法·应用免疫组织化学染色和Western blotting,分别检测眼部黑色素瘤[UM和结膜黑色素瘤(conjunctival melanoma,CM)]组织和细胞中APOBEC3B蛋白的表达水平。通过检索癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库,分析UM中APOBEC3B表达水平与预后的关联。使用CRISPR-Cas9质粒APOBEC3B-sgRNA敲除UM细胞系OMM2.3中APOBEC3B基因,构建APOBEC3B敲除的OMM2.3稳转细胞系sgAPOBEC3B以及对照细胞系Vector;并通过克隆形成实验,探索APOBEC3B敲除对OMM2.3细胞增殖的影响。同时,通过APOBEC3B-shRNA和空载质粒建立APOBEC3B敲低的OMM2.3细胞shAPOBEC3B和对照细胞shCtrl,对其进行转录组测序(RNA sequencing,RNA-seq),检测差异基因,并通过基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)揭示APOBEC3B调控的下游通路。通过免疫荧光染色鉴定下游通路的关键蛋白。通过应用通路靶向药物处理,检测APOBEC3B对UM药物治疗敏感性的影响。结果·免疫组织化学染色结果表明眼部黑色素瘤(UM和CM)组织相较于良性色素痣组织APOBEC3B表达更高。Western blotting也表明包括OMM2.3细胞在内的大多数眼部黑色素瘤细胞相较于正常对照细胞(视网膜色素上皮细胞)APOBEC3B蛋白表达水平更高。并且TCGA数据库分析表明,APOBEC3B高表达的UM患者总生存期(P=0.032)和无病生存期(P=0.000)更短。然而APOBEC3B敲除并不影响OMM2.3细胞克隆形成的能力,APOBEC3B敲低也没有造成细胞周期的显著改变。shAPOBEC3B和shCtrl细胞系的RNA-seq差异基因富集分析结果显示,APOBEC3B参与调控OMM2.3细胞的复制应激相关通路,并且热图分析也显示APOBEC3B敲低后DNA复制应激相关通路基因表达发生改变。免疫荧光染色结果显示,APOBEC3B敲低后复制应激通路关键靶标磷酸化的复制蛋白A 32 kDa亚基(replication protein A 32 kDa subunit,RPA32)水平降低。在对APOBEC3B敲低的OMM2.3细胞和对照细胞的药物敏感性实验中,发现相较于shAPOBEC3B细胞,shCtrl细胞对细胞周期检测点激酶1(cell cycle checkpoint kinase 1,CHK1)抑制剂的敏感性更高。结论·APOBEC3B参与调控OMM2.3细胞复制应激相关通路,且APOBEC3B表达的OMM2.3细胞对CHK1抑制剂的处理更为敏感。

Brn-2在人脉络膜黑色素瘤细胞系中的表达及其对MART-1基因启动子活性的影响

目的探讨黑色素抗原转录子Brn-2在人脉络膜黑色素瘤细胞系中的表达及其对T细胞可识别抗原-1(melanoma antigen recognized by T cells 1,MART-1)启动子活性的影响。方法采用RT-PCR和Western blot检测人脉络膜黑色素瘤细胞系92-1、92-2、Me1285和Ocm3细胞中Brn-2的mRNA和蛋白表达水平。将含不同长度MART-1基因启动子序列和荧光素酶报告基因的表达质粒p GL3-Luc构建成融合表达载体p GL3-p286-Luc及p GL3-p2956-Luc,与p EV-Brn-2融合表达质粒共转染脉络膜黑色素瘤细胞系细胞。分别测量四种细胞系中p286组、p2956组、p286+Brn-2组、p2956+Brn-2组细胞荧光素酶表达变化,并观察Brn-2对上述细胞MART-1基因启动子活性的影响。结果人脉络膜黑色素瘤细胞系92-1、92-2、Me1285、Ocm3细胞系均可检测到Brn-2 mRNA和蛋白的表达,Brn-2蛋白电泳带大致在相对分子质量47 000处。p GL3-p2956-Luc及p GL3-p286-Luc重组质粒经Apa I和Nhe I双酶切可切出2956 bp和286 bp 2个条带,p EV-Brn-2重组质粒经EcoRI和Bam HI双酶切可切出1329 bp条带。p EV-Brn-2重组质粒分别对人脉络膜黑色素瘤细胞系Ocm3、Mel285、92-2、92-1进行磷酸钙法转染,Western blot检测可见四种细胞系均表达Brn-2蛋白。缺乏Brn-2时,所有细胞的MART-1的p286均显示出活性,MART-1阳性细胞系(92-1、92-2、Ocm3)p286活性高于阴性细胞系(Mel285)。p2956活性不同细胞系表现不同,92-1、92-2中较高,Ocm3中其活性与细胞密度相关,MART-1阴性细胞系中p2956近乎无活性。共转染Brn-2后明显下调92-1、92-2、Ocm3中启动子p286及p2956活性(P<0.05);阴性细胞系Mel285中,Brn-2对启动子活性无影响(P>0.05)。结论 Brn-2表达于人脉络膜黑色素瘤细胞,并下调阳性细胞系MART-1启动子活性。

纺锤体动粒相关复合体-1(SKA1)促进葡萄膜黑色素瘤细胞增殖的分子机制研究

目的研究纺锤体动粒相关复合体-1(SKA1)促进葡萄膜黑色素瘤(UM)细胞增殖的分子机制。方法利用SKA1敲减及空载体慢病毒感染MUM-2B细胞分别作为SKA1敲减组和对照组,再以MTT法、流式细胞术及Caspase-3/7法检测各组细胞增殖、凋亡表型的变化;利用基因表达谱芯片筛选差异基因,KEGG富集分析探寻SKA1促进UM发生发展的潜在信号通路,再以Western blot检测信号通路中关键蛋白的表达变化;利用TCGA数据库UM样本RNA测序及随访数据,分析SKA1表达与预后的关系。结果与对照组相比,SKA1敲减组细胞培养3 d、4 d、5 d的光密度均显著降低(均为P<0.01),而凋亡细胞比例及Caspase-3/7活性均显著增加(均为P<0.01)。KEGG富集分析显示,差异基因富集于P53信号通路。Western blot检测结果证实,SKA1敲减后,P53通路中胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP3)的表达显著下降(P<0.05)。SKA1高表达患者总生存率下降(P=0.021,HR=2.55,95%CI0.92~7.05)。结论SKA1通过P53/IGFBP3信号通路促进UM细胞增殖,而且SKA1高表达是影响UM患者预后的危险因素。

miR-135a/b靶向SIRT1调控葡萄膜黑色素瘤细胞的迁移

目的:研究microRNA-135a/b(miR-135a/b)对葡萄膜黑色素瘤(UM)细胞迁移能力的调控作用及其机制。方法:实验研究。采用定量RT-PCR检测UM标本和癌旁组织中miR-135a/b的表达水平。将miRNA模拟物转染入UM细胞(M23和SP6.5)过表达miR-135a/b,转染无义序列作为对照组(NC)。利用小RNA干扰技术和慢病毒过表达载体感染技术分别下调和上调细胞中SIRT1蛋白表达水平,分别以无义小干扰RNA(siNC)和插入无义序列的慢病毒载体(Lv-NC)作为阴性对照。采用划痕实验和Transwell实验检测细胞的迁移能力。双萤光素酶报告实验用于鉴定miR-135a/b的靶基因。Western blot检测SIRT1蛋白的表达水平。采用独立样本t检验进行数据分析。结果:定量RT-PCR结果显示miR-135a/b在UM组织较癌旁组织的表达水平明显下调(miR-135a:t=6.38,P=0.003;miR-135b:t=23.26,P<0.001)。划痕实验和Transwell实验结果显示,与NC组相比,miR-135a/b过表达M23和SP6.5细胞迁移距离减小(miR-135a:t=36.01、8.98,均P<0.01;miR-135b:t=27.53、10.51,均P<0.01)且迁移细胞数量减少(miR-135a:t=7.04、7.02,均P<0.01;miR-135b:t=5.01、7.32,均P<0.01)。双萤光素酶实验证实,miR-135a/b能够明显抑制SIRT1野生组萤光素酶的荧光值(miR-135a:t=2.88,P=0.028;miR-135b:t=4.99,P=0.003);Western blot结果表明,与NC组相比,过表达miR-135a/b的M23和SP6.5细胞中SIRT1的蛋白水平下调(miR-135a:t=9.93、4.13,均P<0.01;miR-135b:t=4.66、6.20,均P<0.01)。siSIRT1转染后划痕实验和Transwell实验结果显示,与siRNC组相比,M23和SP6.5细胞中下调SIRT1蛋白水平后细胞的迁移距离减小(siSIRT1-I:t=13.88、11.78,均P<0.01;siSIRT1-II:t=31.20、6.27,均P<0.01)且迁移细胞数量减少(siSIRT1-I:t=7.57、4.66,均P<0.01;siSIRT1-II:t=5.58、3.25,均P<0.05)。M23和SP6.5细胞中上调SIRT1蛋白水平同时过表达miR-135a/b,Transwell实验结果显示,细胞的迁移数量较仅过表达miR-135a/b升高(miR-135a+Lv-SIRT1:t=4.10、2.75,均P<0.05;miR-135b+Lv-SIRT1:t=2.99、2.49,均P<0.05)。结论:miR-135a/b在UM中明显下调且通过靶向结合SIRT1 mRNA 3'非翻译区抑制UM细胞的迁移,提示miR-135a/b-SIRT1信号轴在UM发展中发挥重要作用。

细胞周期相关基因在葡萄膜黑色素瘤中的表达与意义

目的 探讨细胞周期相关基因与葡萄膜黑色素瘤病理分型及浸润能力的关系。 方法 采用免疫组化法定量检测 96例葡萄膜黑色素瘤标本中 cyclin D1和 Bcl- 2蛋白的表达。 结果 Bcl- 2在所有葡萄膜黑色素瘤中均有较高表达 ,与病理学分型及巩膜外浸润无关 ;cyclin D1的表达依梭型、混合型、上皮型逐渐增高 ,与肿瘤的浸润能力呈正相关。 结论 bcl- 2的表达对于葡萄膜黑色素瘤细胞的存活具有重要作用 ,cyclin

MicroRNA-34a抑制葡萄膜黑色素瘤细胞增殖的研究

该文采用阳离子脂质体Lipofectamine介导的方法将microRNA-34a转染入体外培养的人葡萄膜黑色素瘤细胞M23和SP6.5。应用BrdU法、细胞平板克隆形成实验检测转染microRNA-34a后对细胞增殖的影响,发现M23和SP6.5细胞增殖明显被抑制(P<0.01);并利用流式细胞技术检测转染microRNA-34a后细胞周期的变化,发现细胞停滞于G_1期;同时检测转染microRNA-34a后细胞caspase-3/7酶的活性,发现无明显改变。另外,Real-time PCR检测表明阿霉素处理后M23、SP6.5细胞中microRNA-34a的表达量上调(P<0.01)。用阿霉素处理转染microRNA-34a的M23、SP6.5细胞,检测caspase-3/7酶活性的改变,发现caspase-3/7酶活性显著增加(P<0.01)。本研究表明microRNA-34a通过抑制细胞周期来抑制体外培养的人葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖,能够增加细胞对阿霉素的敏感性,但不直接诱导细胞凋亡。