牛支原体微滴式数字PCR检测方法的建立及应用

为建立检测牛支原体(M. bovis)的微滴式数字PCR(ddPCR)方法,本研究以牛支原体uvrC基因为靶基因,设计特异性引物和探针,采用方阵法对ddPCR退火温度、引物和探针浓度的优化,结果显示,建立的ddPCR方法最佳退火温度为62.6℃,最佳引物和探针终浓度分别为900 nmol/μL和250 nmol/μL。利用该方法检测M. bovis、牛传染性鼻气管炎病毒、牛鼻炎病毒B型、副结核分枝杆菌、口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛轮状病毒等,结果显示仅能够特异性检测到M. bovis,对其他病原均无交叉反应,特异性强;分别以10倍倍比稀释(1.2×10^(4)拷贝/μL~1.2×10^(-2)拷贝/μL)后的重组质粒标准品pMD19-T-uvrC为模板,进行敏感性试验,结果显示该ddPCR方法的检测下限为1.2拷贝/μL,是荧光定量PCR方法敏感性的10倍,该ddPCR敏感性高;对该ddPCR进行组内和组间重复性试验,结果显示其组内和组间变异系数均小于5%,重复性好。取23份来自患有乳房炎奶牛的新鲜牛奶和40份来自有呼吸道症状的牛鼻拭子样品,分别通过ddPCR、病原分离鉴定和荧光定量PCR方法检测M. bovis,结果显示,阳性率分别为42.86%(27/63)、33.33%(21/63)和33.33%(21/63),该ddPCR敏感性高于病原分离鉴定和荧光定量PCR方法,ddPCR方法与上述两种方法的符合率均为62.9%。本研究建立的ddPCR方法灵敏度高、特异性强,可对牛支原体进行定量检测,为牛支原体感染的早期监测和精准检测提供了可行技术手段。

干酪乳杆菌的近缘种及亚种部分看家基因的系统发育分析

【背景】16S rRNA基因序列分析已广泛应用于细菌的分类鉴定,但是存在一定局限性,而使用看家基因作为分子标记在近缘种及亚种间的系统发育分析中具有其独特的优势。【目的】研究16S rRNA、uvr C (核酸外切酶ABC,C亚基)和mur E (UDP-N-乙酰胞壁酰三肽合酶)基因序列对干酪乳杆菌的近缘种及亚种的区分能力。【方法】采用分离自传统发酵乳中的6株干酪乳杆菌为研究对象,选取uvr C和mur E基因片段,通过PCR扩增、测序,结合已公布的干酪乳杆菌的近缘种或亚种的相应序列计算遗传距离、构建系统发育树,并与16S rRNA基因序列分析技术进行比较。【结果】研究发现Lactobacilluscasei及相近种间的uvr C、mur E和联合基因(uvr C-mur E)构建的系统发育树拓扑结构与16S rRNA基因结果基本一致,区别在于相似性的不同,其分别为79.00%-99.16%、89.08%-99.20%、76.56%-99.69%和99.58%-100%。基于16S rRNA基因不能区分干酪乳杆菌的近缘种及亚种,而看家基因uvr C和mur E基因序列能够很好地区分干酪乳杆菌的近缘种及亚种,并且将uvr C和mur E基因串联使用后,试验菌株与参考菌株的分类关系更加清晰。【结论】联合基因(uvr C-mur E)可作为16SrRNA基因的辅助工具用于干酪乳杆菌的近缘种及亚种的快速准确鉴定。