大肠杆菌表达的vMIP-Ⅱ包涵体的纯化与复性研究

目的纯化、复性大肠杆菌表达的vMIPⅡ包涵体蛋白。方法用8molL尿素缓冲液变性溶解vMIPⅡ包涵体,然后加入十二烷基磺酸钠(SDS)进一步促溶,利用金属亲和层析和分子筛层析纯化,再利用柱层析去除SDS,纯化后透析复性;通过荧光和单核淋巴细胞趋化抑制实验检测复性蛋白的结构和抑制单核淋巴细胞趋化的活性。结果重组vMIPⅡ纯化和复性后,仍具有完整的高级结构和抑制单核细胞趋化的活性。结论已获得了重组vMIPⅡ活性蛋白,为进一步研究应用奠定基础。

vMIP-Ⅱ各受体结合活性位点分析

目的探索vMIP-II结合趋化因子受体的活性位点以便有目的地对其进行改构。方法应用生物信息学方法对影响vMIP-II受体结合的氨基酸残基进行预测分析。结果vMIP-II对不同的受体有不同结合位点,其与CC类趋化因子受体结合位点主要在核心骨架,与CXC类趋化因子受体结合位点主要在N端。结论vMIP-II是一种极佳的趋化因子受体阻断剂类新药开发先导物。

细胞穿膜肽pep-1与vMIP-Ⅱ的融合表达与纯化

细胞穿膜肽是一类能携带大分子物质进入细胞的短肽,其穿膜能力不依赖经典的胞吞作用。本研究构建了含有细胞穿膜肽pep-1和病毒巨噬细胞炎症蛋白-Ⅱ(viral macrophage inflammatory protein-Ⅱ,vMIP-Ⅱ)的融合表达质粒pET15b-pep-1-vMIP-Ⅱ,并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS中经IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western-blot鉴定出可溶性的融合蛋白pep-1-vMIP-Ⅱ。通过对IPTG浓度、温度等诱导表达条件进行优化,确定在IPTG浓度为0.2mmol/L、28℃下诱导7h可溶性蛋白的表达量相对较高,经Ni-NTA亲和层析,超滤除盐纯化获得高纯度的融合蛋白pep-1-vMIP-Ⅱ,将该蛋白作用于Hela细胞,激光共聚焦显微镜观察结果显示该融合蛋白能够携带目的基因穿透细胞膜。本文结果将为进一步研究vMIP-Ⅱ的功能和细胞穿膜肽技术的应用奠定基础。

vMIP-Ⅱ对SIV感染的食蟹猴TCRVβ基因表达的影响

目的检测感染SIV初期用病毒巨噬细胞炎症蛋白-Ⅱ(vMIP-Ⅱ)治疗的食蟹猴外周血T细胞TCRVβ优势表达,分析特异性Vβ亚家族表达水平的变化及T细胞克隆性质的改变。方法11只食蟹猴感染前后外周血PBMC样本共22例通过半定量RT-PCR技术分析其中14个TCRVβ亚家族T细胞的表达情况,运用基因扫描技术分析用药组与感染组差异表达的T细胞TCRVβ7亚家族基因中CDR3的长度了解其克隆性。结果与感染前正常食蟹猴外周血T细胞的14个TCRVβ亚家族中表达(除去表达量极低的10个亚家族)相比较,感染后SIV组中部分样品Vβ7、8、14、16的表达量与感染前比较有上升趋势;vMIP-Ⅱ组中TCRVβ亚家族的表达量上升更加明显。基因扫描结果显示感染前、后标本中Vβ7亚家族的表达由多克隆向寡克隆变化的趋势。结论体内实验研究表明,SIV感染初期的食蟹猴体内部分TCRVβ亚家族有特异性的增生,且克隆性发生改变。vMIP-Ⅱ对此种Vβ亚家族的表达的增生有促进的作用,推测其促使特异性应答的免疫细胞的增生。

紫杉醇长循环纳米胶束联合vMIP-ⅡN端肽逆转乳腺癌细胞耐药的研究

目的:探讨紫杉醇长循环纳米载药胶束联合病毒巨噬细胞炎性蛋白Ⅱ(vMIP-Ⅱ)N端肽(NT21MP)对乳腺癌紫杉醇耐药细胞株(MCF-7/PR)耐药性的影响。方法:采用磺酰罗丹明B(SRB)染色法检测乳腺癌耐药细胞株MCF-7/PR的存活率;细胞划痕及Transwell实验检测紫杉醇纳米载药胶束联合NT21MP对乳腺癌耐药细胞迁移、侵袭能力的影响;流式细胞术分析细胞凋亡、周期;Western blotting实验检测细胞凋亡、耐药及上皮间充质转化相关蛋白水平表达。结果:相对于紫杉醇组,紫杉醇纳米胶束更有效地抑制细胞增殖、迁移和侵袭,凋亡蛋白Bax、caspase3的蛋白表达水平上调,抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平下调,且耐药相关蛋白MRP、P-gp和EMT相关蛋白Vimentin、Slug表达水平下调,E-cadherin表达上调(P<0.01);相对于紫杉醇纳米胶束组,紫杉醇纳米胶束与NT21MP联合组对细胞增殖、迁移、侵袭、细胞周期的抑制,以及抗凋亡和逆转耐药作用更明显(P<0.01)。结论:紫杉醇纳米胶束可有效发挥逆转乳腺癌细胞耐药性的作用,且以紫杉醇纳米胶束联合多肽药物NT21MP作用更明显。

TUNEL法检测重组vMIP-Ⅱ对SIV感染模型淋巴细胞凋亡的影响

目的 探讨TUNEL技术检测的vMIP -Ⅱ对SIV感染的猴淋巴组织中淋巴细胞凋亡的影响是否与其引起的感染淋巴组织中细胞的增殖有关。方法 取 3个剂量组的vMIP -Ⅱ注射治疗后的SIV感染模型的淋巴组织标本 ,用TUNEL法检测每个剂量组动物模型淋巴细胞凋亡率。结果 vMIP -Ⅱ治疗的 3个剂量组与实验对照组相比、组间相比细胞凋亡率无显著性差异 (P >0 . 0 5 )。结论 3个剂量组的vMIP Ⅱ对SIV感染后的猴淋巴组织淋巴细胞凋亡无影响 ,但药物剂量与细胞凋亡率却呈负相关。

广谱趋化因子受体结合物-vMIP-II的体内抗SIV功能研究

病毒巨噬细胞炎症蛋白II(vMIP-II)是一种广谱趋化因子受体拮抗剂,它所拮抗的趋化因子受体被认为是不同的人免疫缺陷病毒株(Human immunodeficiency virus,HIV)进入靶细胞的辅受体。虽然理论上vMIP-II是一个广谱的HIV抑制剂,但vMIP-II的抗HIV感染作用却少有报道,特别是体内研究。本研究利用一个有效的SIV-mac251感染食蟹猴模型来评价vMIP-II的体内抗HIV感染作用,结果显示vMIP-II能够有效地并呈剂量依赖性地降低食蟹猴血浆病毒载量,同时对宿主免疫功能具有保护作用。这些结果表明vMIP-II是一种有效的抗HIV物质,可以作为一类新型的抗HIV先导药物,也为研发靶向病毒进入的新药提供了进一步的理论支持。

病毒巨噬细胞炎性蛋白Ⅱ N端肽调控SDF-1α/CXCR4诱导趋化机制

目的:评价病毒巨噬细胞炎性蛋白ⅡN端肽(NT21MP)是否通过干扰SDF-1α/CXCR4信号抑制人乳腺癌细胞株SKBR3细胞的趋化作用。方法:以RT-PCR和免疫组化检测SKBR3和MCF-7两种人乳腺癌细胞中CXCR4的表达;用细胞转移实验检测在NT21MP存在或缺乏的情况下SDF-1α诱导SKBR3细胞的趋化作用;以Fluo3/AM为细胞内游离钙离子的荧光指示剂,用激光扫描共聚焦显微镜测定NT21MP对SDF-1α诱导SKBR3细胞内游离钙浓度的影响;Western blot分析ERK1/2和FAK蛋白的磷酸化水平变化。结果:相对于MCF-7细胞,SKBR3细胞中CXCR4蛋白表达水平较高;经SDF-1α处理后,SKBR3的迁移能力提高,CXCR4抑制剂AMD3100可有效抑制SKBR3细胞的迁移,细胞经NT21MP预处理后,可剂量依赖性地抑制SKBR3细胞的迁移(P<0.05);NT21MP也可抑制由SDF-1α诱导的细胞内Ca2+峰值(P<0.05),而钙离子浓度升高是SKBR3细胞迁移的重要信号之一;另外,相对于阴性对照组,NT21MP也可下调SDF-1α诱导的SKBR3中信号蛋白ERK1/2和FAK的磷酸化水平(P<0.05)。结论:NT21MP可抑制SDF-1α诱导的SK-BR3细胞的迁移,可能与其上游钙离子释放和ERK1/2及FAK磷酸化阻断信号有关。

重组趋化因子vMIP-II在大肠杆菌中的表达和纯化

目的 重组病毒巨噬细胞炎性蛋白Ⅱ (viralmacrophageinflammatoryproteinⅡ ,vMIPⅡ )在大肠杆菌中表达及纯化。方法 以pET32a(+)vMIPⅡ为重组趋化因子vMIPⅡ克隆基因的表达质粒 ,以大肠杆菌BL2 1(DE3)pLysS为表达菌 ,在IPTG诱导下表达出一个由 2 30个氨基酸残基组成的硫氧还蛋白 (thioredoxin)vMIPⅡ的融合蛋白 (2 6×10 3 )。经细菌裂解、金属离子螯合亲和层析、肠激酶消化以游离vMIPⅡ及阳离子交换层析等步骤纯化目的蛋白 ,以配体结合实验鉴定纯化产物的生物学活性。结果 从 1L发酵菌液中可获得高纯度目的蛋白约 4～ 6mg。配体结合实验表明 ,该产物能与CCR5结合 [Kd =(10 .90± 1.0 7)nmol/L]。结论 采用本方法可获得高表达、高纯度的具有生物学活性的重组病毒趋化因子vMIPⅡ。

vMIP-ⅡN端重组肽的表达纯化及活性鉴定

病毒巨噬细胞炎症蛋白-Ⅱ(viralmacrophageinflammatoryprotein-Ⅱ,vMIP-Ⅱ)由卡波西肉瘤疱疹病毒编码,前期研究证明了vMIP-IIN端21肽(NT21MP)选择性的阻断趋化因子CXCR4,从而抑制乳腺癌细胞趋化的活性。通过化学合成法获得编码vMIP-ⅡN末端的基因序列,与pGEX-KG(克隆位点的N-端有谷胱甘肽转移酶GST标签序列)连接构建原核表达载体,重组质粒在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中获得表达,免疫印迹显示重组蛋白GST-NT21MP主要在细菌裂解液上清中表达,可溶性部分经亲和层析、超滤、快速蛋白液相色谱(fastproteinliquidchromatography,FPLC)纯化获得高纯度的GST-NT21MP蛋白。利用Transwell趋化试验测定GST-NT21MP的活性。结果显示,重组蛋白GST-NT21MP能够抑制乳腺癌细胞SK-BR-3的趋化活性,可作为治疗乳腺癌转移的潜在性靶向药物。

病毒巨噬细胞炎性蛋白-Ⅱ在毕赤酵母中的表达及其抗HIV-1活性

目的在毕赤酵母中表达病毒巨噬细胞炎性蛋白-Ⅱ(Viral macrophage inflammatory protein-Ⅱ,vMIP-Ⅱ),并检测其抗HIV-1活性。方法通过PCR技术从质粒pQE-vMIP-Ⅱ中扩增vMIP-Ⅱ基因,插入酵母表达载体pPICZaA中,构建表达质粒pPICZaA-vMIP-Ⅱ,转化毕赤酵母菌X33,甲醇诱导表达。表达产物经镍离子亲和层析和分子筛层析纯化后,进行Western blot鉴定,并检测重组vMIP-Ⅱ蛋白对HIV-1诱导的细胞合胞体形成的抑制作用。结果重组表达质粒pPICZaA-vMIP-Ⅱ经酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的重组vMIP-Ⅱ蛋白的相对分子质量约为8 500,以分泌形式表达于重组酵母菌的发酵上清中;纯化的重组蛋白纯度达97.3%,且可与HRP标记的vMIP-Ⅱ多克隆抗体发生反应;重组vMIP-Ⅱ蛋白组的合胞体数目明显少于阳性对照组(P﹤0.05),其IC50值为1.35 ng/ml。结论已成功在毕赤酵母中表达了重组vMIP-Ⅱ蛋白,其具有较强的抑制HIV-1的活性。