大肠杆菌表达的vMIP-Ⅱ包涵体的纯化与复性研究

目的纯化、复性大肠杆菌表达的vMIPⅡ包涵体蛋白。方法用8molL尿素缓冲液变性溶解vMIPⅡ包涵体,然后加入十二烷基磺酸钠(SDS)进一步促溶,利用金属亲和层析和分子筛层析纯化,再利用柱层析去除SDS,纯化后透析复性;通过荧光和单核淋巴细胞趋化抑制实验检测复性蛋白的结构和抑制单核淋巴细胞趋化的活性。结果重组vMIPⅡ纯化和复性后,仍具有完整的高级结构和抑制单核细胞趋化的活性。结论已获得了重组vMIPⅡ活性蛋白,为进一步研究应用奠定基础。

截短型人转化生长因子βⅡ型受体胞外域的表达及活性分析

目的构建截短型人转化生长因子βⅡ型受体胞外域(thTβRⅡ)原核表达载体,诱导表达纯化thTβRⅡ蛋白,并分析其生物学活性。方法以本实验室前期构建的TβRⅡ全长基因片段(p GEX-4T1-TβRⅡ)为模版,常规PCR扩增出带有Nde I和Bam HI酶切位点的thTβRⅡ目的基因,并插入原核表达载体p ET28a,命名为p ET28a-thTβRⅡ。将经过PCR、双酶切和DNA测序正确的p ET28a-thTβRⅡ转化至大肠杆菌Rossta诱导表达,用Ni^(2+)亲和层析纯化获得高纯度thTβRⅡ目的蛋白,经SDS-PAGE进行纯度分析,MTT法观察其对转化生长因子-β1(TGF-β1)活化的人肝星状细胞LX-2增殖活性的影响,real-time RT-PCR及Western blot检测其对TGF-β1、纤连蛋白(FN)mRNA及FN、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达的影响。结果 p ET28a-thTβRⅡ原核表达载体构建成功,宿主菌Rossta/p ET28a-thTβRⅡ在37℃经0.8mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导5 h获得目的蛋白thTβRⅡ的大量表达,目的蛋白主要以包涵体的形式存在,通过Ni^(2+)亲和层析成功获得高纯度thTβRⅡ,SDS-PAGE鉴定分子量约为18.0 kD,MTT显示150μg/mL的重组蛋白thTβRⅡ能明显抑制活化的人肝星状细胞LX-2增殖,real-time RT-PCR及Western blot显示200μg/mL的重组蛋白thTβRⅡ其能显著减少TGFβ1、FNmRNA;FN、α-SMA蛋白的表达。结论成功构建thTβRⅡ原核表达载体,诱导表达纯化并获得高纯度重组蛋白thTβRⅡ,其能抑制活化的LX-2细胞增殖并具有抗纤维化作用,为进一步体内外功能研究打下基础。

眼咽型远端型肌病二家系的临床、病理及分子学特点

目的探讨2个眼咽型远端型肌病（OPDM）家系的临床、病理及分子生物学特点。方法对2个家系的先证者行血清肌酶、肌电图、肌肉活体组织检查、肌肉酶组织染色及电镜分析，并于复诊时提取其静脉血DNA样本，进一步行编码多聚腺苷酸结合蛋白核1（PABPN1）、GNE基因突变分析。结果家系1为同代3兄弟发病，家系2为2代4人发病。起病以发音困难伴双下肢无力居多；以发音及吞咽困难为表现的咽部肌群受累较突出。肌肉超微结构电镜分析未见到眼咽型肌营养不良样核内包涵体，2家系先证者PABPN1基因GCN重复拷贝数均为正常（10次，GCG6GCA3GCG1），且GNE基因2～12号外显子均未发现突变。结论2个OPDM家系起病年龄、形式与日本患者类似，但肌肉受累方式有所不同。家系1为中国首个常染色体隐性遗传OPDM家系。本研究结果证实OPDM是一个表型、病理、遗传学独立的肌病实体。