PEDV、TGEV与PDCoV S蛋白表位基因三联疫苗的构建及其鉴定

[目的]构建一种同时预防猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的三联表位疫苗,以预防上述病原导致的猪的相关疾病。[方法]本研究运用免疫信息学在线软件对3种猪肠道冠状病毒(SeCoVs)的S蛋白B、T细胞表位进行预测分析,构建新的表位肽段,命名为PPT,通过ExPASy、VaxiJen、TMHMM、SOPMA、SOLpro和AlphaFlod2等在线软件对PPT进行生物信息学分析,并利用C-IMMSIM在线软件对其免疫反应进行模拟。通过T2A将PPT与PEDV的COE序列、TGEV的SAD序列及PDCoV的CTD序列连接并构建至真核表达载体pEGFP-N1,经PCR和双酶切鉴定正确后,将获得的重组质粒转染HEK293A细胞,经DAPI染色、CCK8、RT-PCR及Western blotting试验验证重组质粒在体外表达情况。[结果]构建的表位蛋白PPT由17条表位肽段组成,经生物信息学软件分析,该蛋白为非跨膜蛋白,结构稳定,具有抗原性和可溶性,亲水性高,无过敏性。C-IMMSIM结果显示,PPT能引起机体树突状细胞(DC)增加,B、T细胞免疫反应,刺激免疫球蛋白IgG、IgM和细胞因子γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)水平升高。重组质粒经PCR和双酶切鉴定结果显示,分别在3359、2375、1064、944、764和467 bp出现特异性目的条带,与预期相符;重组质粒转染HEK293A细胞后,可见绿色荧光;RT-PCR扩增分别在3359、2375、1064、944、764和467 bp处获得与目的基因大小相符的条带;CCK-8检测结果表明,重组质粒对细胞均无明显毒性作用;Western blotting检测结果显示,分别在31.7、16.1、37.9和27.5 ku处出现与目的蛋白分子质量大小一致的条带,重组质粒成功在HEK293A细胞中表达。[结论]本研究基于计算机软件分析设计的PPT表位蛋白成功构建三联疫苗,且在体外表达,为评价PEDV-TGEV-PDCoV三联表位疫苗的免疫效果提供依据。

猪传染性胃肠炎病毒TH-98株S基因核酸疫苗的构建及其免疫效力

利用DNA重组技术,将编码猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)TH-98株的全长S基因和主要抗原位点的Sa片段分别插入真核表达载体pCI的多克隆位点中。应用酶切、PCR方法鉴定阳性重组子pCI-Sa和pCI-S。将昆明鼠随机分成A、B、C 3组(A组为pCI-Sa免疫组、B组为pCI-S免疫组、C组为pCI载体对照组),每组35只,每只鼠肌肉注射100μg,免疫3次,每次间隔2周。于初次免疫后第0、14、21、28、354、2 d采血,用ELISA检测血清抗体动态变化,流式细胞仪检测外周血CD4+和CD8+T细胞数量变化。结果表明,重组真核表达载体均能诱导免疫鼠产生特异性的体液免疫及细胞免疫应答,而且pCI-Sa的免疫效果优于pCI-S。

猪传染性胃肠炎与猪流行性腹泻二联弱毒疫苗的研究

用TGE及PED克隆化弱毒株以1：1配比制成TGE、PED二联弱毒疫苗，毒价为107.0-7.5TCID50／0.3ml，主动免疫与被动免疫的保护率为97.7％及98％。弱毒株毒力稳定，符合制苗标准。免疫期7个月，疫苗保存期一年，疫苗接种猪对同圈饲养的非免疫猪有低效价（16～32倍）的水平感染。6个猪场的田间试验保护率为95％-98％，对紧急预防接种的防制效果更为明显。

携带TGEV DNA疫苗减毒沙门氏菌的构建及安全性与免疫性分析

【目的】探讨以减毒沙门氏菌为载体,进行TGEV DNA疫苗口服免疫可行性。【方法】通过RT-PCR扩增TGEV四川株(SC-H)S基因5’端约2.1 kb的主要抗原位点片段,将其插入真核表达载体pVAX1,构建重组质粒pVAX-S,体外转染COS-7细胞,间接免疫荧光检测S基因表达。通过电转化将pVAX-S转入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,构建SL7207(pVAX-S)重组菌,并在体外感染小鼠腹腔巨噬细胞,以RT-PCR、间接免疫荧光检测细胞内S基因的转录与表达情况。将SL7207(pVAX-S)重组菌以5×108、1×109、2×109CFU剂量口服接种BALB/c小鼠,分析其安全性,并以1×109CFU剂量的重组菌3次免疫BALB/c小鼠,通过间接ELISA检测免疫小鼠的血清IgG与肠道粘膜IgA抗体。【结果】成功构建重组质粒pVAX-S,且重组质粒能在COS7细胞中表达。重组菌SL7207(pVAX-S)感染巨噬细胞后检测到目的基因的转录、表达。小鼠口服接种不同剂量重组菌,具有良好的安全性。免疫小鼠于二免后两周可检测到针对TGEV S蛋白的特异性血清IgG与肠道粘膜IgA抗体,且三免后两周与SL7207(pVAX1)空载体免疫组间分别存在显著性差异(P<0.05)和极显著性差异(P<0.01)。【结论】携带TGEV DNA疫苗的减毒沙门氏菌小鼠试验显示了良好的免疫原性与安全性。

猪后海穴接种猪传染性胃肠炎疫苗对母乳及仔猪血清中IL-2含量的影响

应用放射免疫分析方法 ,测定比较了猪后海穴穴位免疫与常规口服、肌肉途径免疫猪传染性胃肠炎疫苗后 ,母猪初乳、常乳及免疫仔猪血清中 IL -2的含量。结果表明 ,初乳中 IL-2的含量以穴位免疫最高 ;常乳中 IL-2含量各种免疫途径基本一致 ,处于较低水平。仔猪免疫后 3d,血清中 IL-2含量 ,穴位免疫与口服免疫基本一致 ,但均高于肌肉免疫及对照 ;免疫后 7d,血清中 IL-2含量 ,穴位免疫高于口服、肌肉免疫。从免疫调节因子方面看出 。

以乳酸杆菌为载体的猪传染性胃肠炎病毒S基因A、D抗原位点DNA疫苗的构建

应用pRc/CMV2真核质粒骨架,先后插入猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因AD抗原位点片段和乳酸杆菌复制子基因Rep.8014,构建了pRc/CMV2-SAD-Rep.8014真核表达穿梭质粒。将其转染PK-15细胞,RT-PCR检测到S基因A D抗原位点的mRNA表达。随后,将pRc/CMV2-SAD-Rep.8014质粒电转化猪源的Lactobacillus acidophilusSW1株,成功构建了以乳酸杆菌为载体的带有TGEV S基因AD抗原位点的DNA疫苗株L.acidophilusTGES-1。本研究结合了乳酸杆菌胃肠道常在共生菌的优势和TGE呈现肠道局部发病的特点,达到益生性与免疫预防的双重功效,对乳酸杆菌口服DNA疫苗进行了有益的探索。

猪传染性胃肠炎与猪流行性腹泻穴位针刺免疫的研究

以猪传染性胃肠炎（ＴＧＥ）弱毒疫苗经与胃肠道疾病相关的足阳明胃经６个穴位和督脉经后海穴位共７个穴位的穴位免疫筛选试验，证明后海穴接种为３／３保护，是首选的接种穴位。以后海穴取代ＴＧＥ苗原鼻内途径的第二次接种，免疫４头妊娠母猪，对所产仔猪的保护数为３７／４１。以小剂量０．１ｍｌ及０．２ｍｌ后海穴接种３日龄仔猪，保护率分别为６０．５３％及１００％，而口服０．１ｍｌ只保护６．６７％。针刺１．５ｃｍ及３．０ｃｍ深度注苗的穴位刺激参数试验均获全保护。针刺点旁离穴位０．５ｃｍ及１．０ｃｍ分别获１００％及７５％保护，而同时设的肌肉途径接种组只获２５％保护，首次证明后海穴具有相对免疫特异性。ＴＧＥ灭活苗后海穴一次接种被动免疫保护率为７７．４５％，主动免疫为９５％。猪流行性腹泻（ＰＥＤ）灭活苗被动免疫保护率为９７．０３％，主动免疫试验０．１ｍｌ及０．５ｍｌ的保护率分别为７７．７８％ｍ和８５％。ＴＧＥ、ＰＥＤ二联灭活苗的被动免疫试验的总保护率ＴＧＥ为８７．９％ＰＥＤ为８２．４％。注苗后攻毒前ＴＧＥ与ＰＥＤ的中和抗体价均为１∶１２８，攻毒后７～１０天中和抗体价均为１∶２５６，主动免疫试验的总保护率：ＴＧＥ为１００％，ＰＥＤ为９７?

甲壳素对猪传染性胃肠炎免疫调节作用的研究

研究了甲壳素对猪传染性胃肠炎疫苗的免疫调节作用 ;用浓碱法处理甲壳素可获得吸附能力强的佐剂 ,但物理性状不适合用于疫苗佐剂 ;壳聚糖可用作制备具有良好水溶性的疫苗佐剂 ,经与白油和蜂胶等佐剂比较 ,表明该佐剂对猪传染性胃肠炎具有一定的免疫调节作用。即 4种佐剂的疫苗在免疫后 14d ,壳聚糖疫苗组抗体效价显著高于其它组 ;免疫后 30～ 12 0d油乳剂疫苗组抗体效价显著高于其它组。

中西医结合治疗猪传染性胃肠炎

猪传染性胃肠炎(TGE)是一种以呕吐、严重腹泻、失水和对新生仔猪有高病死率为特征的高度接触性胃肠疾病。多发于冬春季节,该病无特效治疗方法,仔猪死亡率高达100%。笔者根据多年临床经验,采用中西医结合治疗10例218头仔猪,治愈率93.7%,效果显著。

猪传染性胃肠炎病毒基因工程疫苗研究进展

猪传染性胃肠炎是由猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起猪的一种高度接触性肠道疾病,可导致仔猪发生严重的呕吐、腹泻与脱水,死亡率可达100%。口服疫苗是TGEV基因工程疫苗研究的主要方向,目前已在腺病毒、细菌、转基因植物及DNA疫苗中对TGEV的S基因进行了表达,并对其口服免疫后的免疫原性进行研究。现针对TGEV基因工程疫苗近年来研究的概况进行综述,分析其优点与不足,并对其未来的发展进行展望。

猪传染性胃肠炎疫苗研究进展

猪传染性胃肠炎是由猪传染性胃肠炎病毒引起的一种急性、高度接触性肠道传染病,不同年龄和品种的猪均可感染,严重危害着全世界养猪业的健康发展。疫苗接种是防控本病的关键措施之一。常规疫苗在防控猪传染性胃肠炎中发挥了巨大的作用,但在某种程度上存在不可避免的缺陷,对根除和消灭传染病带来了严重困难。随着分子生物学技术的不断发展,基因工程疫苗的研究也不断深入,给本病的防控带来了新的思路。论文对猪传染性胃肠炎疫苗的研究进展进行了综述,特别是对亚单位疫苗、核酸疫苗、重组活载体疫苗等基因工程疫苗的研究进行了比较深入的概括。

猪传染性胃肠炎病毒疫苗株S基因的克隆及其与流行株的比对分析

[目的]分析猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)疫苗株和流行株S基因的遗传变异特征。[方法]利用RT-PCR方法对国内目前广泛使用的TGEV疫苗株A、B、C的S基因进行克隆并测序,将获得的序列与近年来公开发表的分离自不同地区的TGEV毒株S基因序列进行比对分析;选取NCBI中登录号为AF104420.1-Britain、AY587882.1-Nanjing、DQ811786.2-America、EU074218.2-Harbin、FJ755618.2-Harbin、JQ700304-fuzhou、KC609371.1-Shanghai、KX900411.1-United States、M94099.1-Spain和MK272773.1-Fushun的TGEV流行株S基因序列,与疫苗株A、B、C的S基因序列一起,利用MegAlign软件进行比对分析。[结果]疫苗株A、B、C的S基因序列两两间的同源性均在96.7%以上;疫苗株A、B、C的S基因序列与NCBI中流行株S基因序列的同源性分别在94.43%~99.82%、95.30%~99.64%、93.48%~98.38%;由遗传进化树可知,疫苗株A、C与国外流行株M94099.1-Spain在同一分支上,疫苗株B与国内流行株JQ700304-fuzhou在另一分支上。[结论]TGEV疫苗株的S基因与流行株同源性较高,变异性不大。

猪病毒性腹泻疫苗研究进展

猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒是当前猪病毒性腹泻的主要病原,临床表现主要为呕吐、水样腹泻、脱水、逐渐消瘦等症状。不同年龄和品种的猪均可感染,严重危害养猪业的健康发展。疫苗接种是防控猪病毒性腹泻的关键措施之一,但大量临床试验显示抗体阳性率低,免疫效果不佳。文章针对猪病毒性腹泻疫苗的研究进展进行综述,旨在为临床上预防猪病毒性腹泻提供参考。

部分地区传染性胃肠炎病毒株S基因的序列分析

猪传染性胃肠炎(Porcine Transmissible Gastraenteritis,TGE)是猪的一种高度接触性肠道疾病。收集不同地区猪传染性胃肠炎病毒株的S基因为靶序列,利用生物信息学方法分析不同地区TGEV病毒株S基因的同源性和进化性关系,序列分析包括遗传距离测定、进化树分析和碱基替换分析等。结果表明S基因在TGEV不同毒株间高度保守,但S基因存在腺嘌呤碱基(A)向胸腺嘧啶(T)突变的倾向。通过对TGEVS基因核苷酸序列分析可为深入研究TGEV的毒力变化和流行病学提供参考。

部分地区猪传染性胃肠炎病毒株ORF7基因的序列分析

猪传染性胃肠炎(Porcine Transmissible Gastraenteritis,TGE)是猪的一种高度接触性肠道疾病。以不同地区猪传染性胃肠炎病毒株的ORF7基因为靶序列,序列分析不同地区TGEV病毒株ORF7基因的同源性和进化性关系,序列分析包括同源性比较、进化树分析和碱基替换分析等。结果表明:ORF7基因在TGEV不同毒株间高度保守,但ORF7基因存在腺嘌呤碱基(A)向胸腺嘧啶(T)突变的倾向。通过对TGEVORF7基因核苷酸序列分析可为深入研究TGEV的毒力变化和流行病学提供参考。

基于网络药理学探究乌梅散加减方治疗猪传染性胃肠炎的作用机制

【目的】借助网络药理学手段探究乌梅散加减方治疗猪传染性胃肠炎(TGE)的作用机制。【方法】利用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)、Swiss TargetPrediction获取乌梅散加减方的活性成分与作用靶点,应用公共比较毒理基因组学数据库(CTD)获取TGE的相关靶点,使用STRING数据库绘制乌梅散加减方与TGE交集靶点的蛋白互作(PPI)网络图,利用DAVID对交集靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析,探究乌梅散加减方治疗TGE的作用机制。【结果】从乌梅散加减方中共筛选到槲皮素、山柰酚、芒柄花素等125种活性成分和JUN原癌基因(JUN)、肿瘤坏死因子(TNF)、信号传导与转录激活因子3(STAT3)等58个作用靶点。GO功能富集分析显示,共得到生物过程138个条目,涉及免疫反应、血管内皮因子生成、RNA聚合酶Ⅱ启动子对pri-miRNA转录的正调控等;细胞组分13个条目,涉及胞外区、细胞外空间、膜筏等;分子功能32个条目,涉及细胞因子活性、生长因子活性、白细胞介素2(IL2)受体活性等。KEGG通路富集分析显示,共得到135条信号通路,其中IL17信号通路、Th17细胞分化、TNF信号通路、HIF-1信号通路是乌梅散加减方治疗TGE的主要信号通路。【结论】乌梅散加减方主要通过槲皮素、山柰酚、芒柄花素等多个活性成分调控JUN、TNF、STAT3等靶点,通过参与IL17信号通路、Th17细胞分化等治疗TGE。

猪传染性胃肠炎病毒S基因A、D抗原共表达的复制缺陷型重组腺病毒构建及鉴定

通过RT-PCR技术和重叠PCR技术扩增出含有猪传染性胃肠炎病毒S基因的A抗原表位和D抗原表位,构建复制缺陷型腺病毒穿梭质粒。穿梭质粒与腺病毒骨架质粒经PacI线性化之后,共同转染AD-293细胞,获得共表达A、D抗原表位的复制缺陷型重组腺病毒。经Western Blotting检测,该重组腺病毒能够正确表达目的蛋白基因,而且目的蛋白能够与猪传染性胃肠炎阳性血清反应。本研究结果为猪传染性胃肠炎重组疫苗研发奠定基础。

猪传染性胃肠炎疫苗免疫效果的研究

本试验采用TGEV-ELISA抗体检测试剂盒对一规模化猪场仔猪从出生到出栏的传染性胃肠炎抗体进行了跟踪监测,以掌握TGEV抗体的消长变化,最终确定仔猪传染性胃肠炎疫苗的初免时间为10日龄(1头份),加强免疫时间为28日龄(2头份)。

猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗血清学效力检验与靶动物免疫攻毒保护相关性研究

以实验室试制的3批猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗(JL株+HN-1株),对3~5日龄仔猪进行接种,免疫后14、21 d分别采血,分离血清,检测各组仔猪的TGEV、PEDV中和抗体,并以TGEV和PEDV强毒进行攻毒。结果表明,中和抗体效价的升高,对仔猪的保护率也随之升高,两者呈正相关。当血清中TGEV中和抗体达到132时,可以完全保护仔猪抵抗TGEV强毒的攻击;PEDV中和抗体达到116时,可以完全保护仔猪抵抗PEDV强毒的攻击。

猪传染性胃肠炎病毒卵黄抗体的研制

针对猪传染性胃肠炎病尚无有效的治疗药物,本文研究开发抗猪传染性胃肠炎病毒卵黄抗体,以期为该病的防治提供技术支持。用猪传染性胃肠炎灭活疫苗按程序免疫90~140日龄健康商品海兰褐蛋鸡,三免14天后收集高免蛋进行卵黄抗体提取、ELISA抗体效价检测及攻毒保护试验。高免蛋三免后14天效价可达到1∶256,并维持3个月,三免后120天效价降至1∶128。对1日龄三元杂交仔猪的攻毒保护试验结果表明,未免疫卵黄抗体健康仔猪的发病率、死亡率均达100%;而卵黄抗体免疫组的死亡率为0%、保护率达100%,表明该卵黄抗体能够有效保护猪抵抗传染性胃肠炎病毒的攻击。