色谱技术在抗体分离纯化中的应用进展

抗体作为一类重要的生物药物,在疾病诊断和治疗等方面拥有广阔的前景。抗体药物的需求逐年上升,生产规模不断扩大,下游抗体纯化已经成为抗体药物生产的瓶颈。色谱技术具有选择性好、分离效率高等优点,在抗体纯化领域占据主导地位。抗体分离纯化流程一般包括样品的粗提、粗提物精制和抗体精纯3个步骤,每个步骤都涉及色谱分离技术。目前已有多种色谱技术(如亲和色谱、离子交换色谱、疏水作用色谱、混合模式色谱以及新型的温敏色谱等)应用于抗体的分离纯化。本文介绍了近年来国内外各种色谱技术在抗体分离纯化方面所取得的研究进展,并对抗体色谱分离技术的未来发展趋势进行了展望。

万古霉素的磁性亲和吸附分离

A new kind of magnetic affinity microspheres (MAMS),whose ligand is D\|Ala\|D\|Ala,was prepared using agarose as matrix.By using this new MAMS vancomycin was purified directly from crude fermentation liquor with only one step.The purity and the mass recovery of vancomycin measured by reverse\|phase HPLC were 97% and 87%,respectively.The characteristic of this method was simpler,faster,cheaper and more effective than that of currently used ones.

用壳聚糖亲和磁性微球纯化血浆凝血酶的研究

通过化学共沉淀法合成纳米粒子Fe3O4磁核,以壳聚糖为包裹材料包被自制的磁核,采用乳化交联法制备了具有核-壳结构的磁性高分子微球-壳聚糖磁性微球,并偶联肝素配基得到了一种新型亲和磁性微球,应用SEM、FT-IR、XRD等对微球的粒径、形貌、结构和磁响应性进行了表征.考察了该亲和磁性微球对凝血酶的分离纯化性能,并与传统的DEAE离子交换色谱法进行了比较.结果表明,所得亲和磁性微球具有较窄的粒径分布、形状规整,粒径在50nm左右.对凝血酶一步吸附纯化获得了比活为1879.71U/mg的酶,得率85%,纯化倍数11.057,而传统柱层析法得率为72%,纯化倍数仅为5.33.制备了壳聚糖亲和磁性微球,并将磁分离技术应用于凝血酶的分离纯化,得到了较好的效果,这将对于凝血酶的纯化及生产具有一定参考价值.

蛋白质层析系统在实验教学中的应用

设计"KTAprime plus蛋白质层析系统纯化绿色荧光蛋白(GFP)"的综合实验,以GFP蛋白为研究对象,在大肠杆菌中大量表达重组GFP蛋白,经镍柱亲和层析、离子交换层析以及凝胶过滤层析3种常用层析技术逐步纯化,各步纯化样品经SDS-PAGE鉴定分析,最终获得高纯度的GFP蛋白。通过该实验使学生深入、全面、系统地掌握生命科学研究中最新的蛋白质分离纯化技术,提高学生的科研水平和综合能力。

亲和层析纯化云芝糖肽

目的 :探讨硼配基亲和层析纯化云芝糖肽的新方法。方法 :采用静态方法研究吸附过程的热力学、动力学、最佳吸附解吸条件 ,依据Chase模型求出最大静态吸附容量qm 和吸附常数Kd。结果 :qm=5 5 .5 7mg/g湿基 ,Kd=5 .312g/L ,动态吸附容量 :43 .1mg多糖 /g湿基 ,10 .3mg蛋白 /g湿基。 结论

赶山鞭中黄酮类化学成分研究

目的研究赶山鞭的黄酮类化学成分。方法应用色谱技术进行分离和纯化,采用MS,NMR等波谱鉴定结构。结果从赶山鞭中分到了11个黄酮化合物,分别为5,7,3′,4′-四羟基黄烷醇(Ⅰ)、山萘酚(Ⅱ)、C-3/C-8″双芹菜素(Ⅲ)、槲皮素(Ⅳ)、槲皮素-3′-O-β-D-葡萄糖苷(Ⅴ)、槲皮素-3′-O-L-鼠李糖苷(Ⅵ)、金丝桃苷(Ⅶ)、5,7,3′,4′-四羟基二氢黄酮醇-3-O-鼠李糖苷(Ⅷ)、槲皮素-4′-O-β-D-葡萄糖苷(Ⅸ)、异槲皮苷(X)、槲皮苷(Ⅺ)。结论黄酮类化合物是赶山鞭主要的化学成分,其中化合物Ⅱ,Ⅲ,Ⅴ,Ⅵ,Ⅷ,Ⅸ为首次在该植物中分到。

使用磁性亲和载体纯化rhIFNα

目的：合成可用于分离基因重组干扰素－α的α－ｇａｒｏｓｅ－单克隆抗体磁性微球，并建立一套磁性亲和载体分离蛋白质的方法．方法：使用物理包埋法制备磁性ａｇａｒｏｓｅ载体，使用ＣＮＢｒ法将抗体连接在磁性微球上制备磁性亲和载体．结果：通过优化合成条件，确定单抗的合成条件为ＣＮＢｒ活化用量为２００ｇ／Ｌ磁性载体，单抗的最大偶联量为１５．１ｇ／Ｌ磁性载体．使用磁性单抗载体进行一步纯化，纯化后ＩＦＮ－α的比活性为１．０ｘ１０１１ＩＵ／ｇ，电泳后使用考马斯亮兰染色其纯度为８８％，活性回收率７０％．结论：磁性亲和技术是一个简单、快速分离蛋白质的好方法．

应用高速逆流色谱对穿心莲活性成分进行分离

为了高效分离得到高纯度的穿心莲活性成分,应用高速逆流色谱(HSCCC),在流速为2.0mL/min的正己烷、乙酸乙酯、乙醇和水(体积比为1∶4∶2.3∶2.7)的两相溶剂系统中,从穿心莲的粗提物中同时分离纯化出4种生物活性化合物.利用理化常数、质谱(MS)、核磁共振(1HNMR、13CNMR)等波谱检测技术对其化学结构进行鉴定,发现此4种化合物分别为14-脱氧穿心莲内酯-19-β-D-葡萄糖苷(Ⅰ)、新穿心莲内酯(Ⅱ)、穿心莲内酯(Ⅲ)和14-脱氧穿心莲内酯(Ⅳ).从500 mg粗提物中分离得到4种化合物的量分别是56.8、1.5、108.3和218.0 mg;纯度分别达98.5%、92.5%、96.2%和93.6%;回收率分别为95.5%、97.8%、93.2%和91.9%.说明高速逆流色谱是有效的,可分离得到高纯度产物.

固定化金属螯合亲和层析介质及其应用研究进展

固定化金属螯合亲和层析介质,因其具有固定化配基选择简单且稳定性高、复杂环境中一步纯化蛋白、特异性吸附、目标蛋白质吸附量大、蛋白洗脱条件温和、介质易再生、重复利用率高、制备工艺简单、造价低等多项优点,逐渐成为蛋白质分离纯化及多个相关领域中最有效的分离技术。通过综述固定化金属螯合亲和层析介质的工作原理、构成及应用现状,对固定化金属螯合亲和层析介质应用的前景进行展望。

亲和层析法纯化尿激酶

目的研制尿激酶的纯化工艺,为临床尿激酶制剂提供原料。方法以琼脂糖凝胶为载体,对氨基苯甲脒为配基,采用亲和层析法纯化尿激酶。结果尿激酶活性回收率62.96%,精制品纯化4.03倍。结论该方法特异性强,纯化效果好,酶活性回收率高,可作为尿激酶纯化的一种有效方法。

亲和层析法制备蓖麻毒蛋白

目的研究蓖麻毒蛋白的提取纯化工艺,为制备抗癌生物导弹和生物农药提供原料。方法以琼脂糖凝胶为载体,D-半乳糖为特异性配基,采用亲和层析法纯化蓖麻毒蛋白;并用高效液相色谱法鉴定其纯度。结果该法制备的蓖麻毒蛋白纯度高,收得率好。结论该方法特异性强,制备效率高,可作为制备蓖麻毒蛋白纯品的一种有效方法 。

增强型绿色荧光蛋白的色谱分离和纯化

增强型绿色荧光蛋白(EGFP)是生物领域常用的标记物。在前期成功克隆表达EGFP的基础上,本实验建立了两步分离纯化EGFP的色谱方法,并验证其分离纯化效果,检验EGFP的活性。首先用金属螯合亲和色谱柱His-Trap HP对EGFP的重组菌体破碎上清液进行初步分离,再用葡聚糖凝胶排阻色谱柱Sephadex G-10 HR对其进行脱盐纯化。采用丙烯葡聚糖凝胶排阻色谱柱Sephacryl S-300 HR和十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测分离纯化后的EGFP纯度。最后通过荧光分光检测器和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)验证分离纯化后的EGFP是否具有荧光活性。结果表明该方法可以简便快速地分离纯化EGFP,纯度超过98%,同时保持了EGFP的荧光活性。

葡萄球菌蛋白A的纯化新工艺

目的建立一种高效、简便、实用的分离纯化葡萄球菌蛋白A(SPA)的工艺。方法采用超声波破菌和IgG-Sepharose4B亲和层析分离纯化SPA;以Lowry法检测蛋白含量;双向琼脂免疫扩散法测定效价和特异性;用还原和非还原SDS-PAGE法检测纯度和相对分子质量。结果此法制得的3批SPA的蛋白含量分别为4·7、4·4和5·4mg/ml,收率分别为2·70、2·64和3·78g/100g湿菌。对人IgG的免疫双扩散效价均为1:64;与正常人、豚鼠、家兔和小鼠的血清反应均出现一条沉淀线,而与鸡和羊不出现沉淀线。经非还原SDS-PAGE检测只呈现一条蛋白带,相对分子质量约为160000～180000;经还原SDS-PAGE检测呈现两条蛋白带,相对分子质量分别约为67000和34000。结论已成功建立了分离纯化SPA的新工艺。

一种新型硼亲和磁性纳米吸附剂的制备及其对糖蛋白的分离纯化

通过表面引发-原子转移自由基聚合法,将3-丙烯酰基苯硼酸(AAPBA)原位聚合在Fe3O4@SiO2表面,制备了一种含有苯硼酸聚合物链的磁性纳米吸附剂(Fe3O4@SiO2@-pAAPBA)。通过红外光谱、X射线光电子能谱、热重分析和透射电镜对该吸附剂进行了表征。采用静态吸附法测定了此吸附剂对卵清蛋白和辣根过氧化物酶吸附容量分别为373.9μg·mg^-1和471.3μg·mg^-1,远高于对牛血清白蛋白和溶菌酶的吸附容量,说明此吸附剂对糖蛋白具有较高的吸附容量和吸附选择性。采用磁性分散固相萃取法对糖蛋白和非糖蛋白的混合溶液进行分离,发现此吸附剂仅能对糖蛋白特异性识别。最后,将其应用于鸡蛋清中糖蛋白的分离纯化,获得了良好的效果。

两步柱色谱法分离纯化重组肿瘤血管生长抑制因子Kringle 5

建立了一种用Ni2+螯合的Chelating Sepharose Fast Flow亲和柱色谱和Sephadex G-75凝胶排阻柱色谱分离纯化重组肿瘤血管生长抑制因子Kringle5的方法。采用该工艺得到的重组Kringle5经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明其纯度约为98%,且具有抑制鸡胚绒毛尿囊膜新生血管生成的生物活性。

天蚕素抗菌肽(Cecropin A)融合蛋白的表达及其分离纯化工艺研究

通过单因素实验确定了天蚕素抗菌肽融合蛋白表达的最佳条件,即温度为31℃,种子菌接种量为2.0%,培养基pH值为6.5,诱导时间为10 h,此时融合蛋白的表达量占细胞总蛋白的30.6%;开发融合蛋白纯化工艺,将工程菌细胞超声破碎后,所得包涵体使用8 mol/L尿素溶液溶解,泵入2 mol/L尿素溶液中搅拌使蛋白质复性,复性完成后将2 mol/L尿素溶液通过超滤置换成含0.5 mol/L NaCl、20 mmol/L的PB缓冲液,pH 7.2,并浓缩溶液体积至总体积的30%~40%,采用镍离子亲和层析法纯化Cecropin A融合蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳结果显示目标融合蛋白纯度达到87%以上。

自制填充介质对人血浆凝血因子Ⅸ的层析分离

目的采用自制的DEAE Bio-SepFF和肝素Bio-Sep FF介质,从人血浆中快速分离纯化凝血因子Ⅸ(FⅨ)。方法低温离心去除冷沉淀后的人血浆,在不同淋洗条件下,经过两步弱阴离子交换和一步亲和层析分离纯化FⅨ,用活性检测试剂盒检测各组分凝血因子的活性,Bradford法测定蛋白浓度,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析样品的纯度。结果经过三步层析分离,得到的FⅨ比活达到99.40IU/mg,纯化倍数为3823倍,回收率约为30%,纯度较高。结论采用该方法和介质,可从人血浆中纯化FⅨ,且效果较好。

核酸适配体在样品前处理技术中的应用

核酸适配体是通过指数富集配体系统进化技术经体外筛选得到的可以特异性地识别目标物的一段短的单链寡核苷酸序列。与抗体相比,适配体具有性质稳定、易化学合成、易化学修饰、分子量小和目标分子广泛等优点,目前在生物传感器、毛细管电泳、物质分离富集以及医疗诊断等领域得到了广泛应用。本文重点介绍了核酸适配体在固相萃取、磁分离、亲和色谱及微流控分离分析等样品前处理技术中的应用,并对其应用现状和发展前景进行了综述。

亲和色谱分离技术

亲和色谱是色谱分离技术的重要手段,具有高选择性、高活性回收率和高纯度等特点。综述简单阐述了亲和色谱的起源与发展,详细讨论了不同亲和色谱在不同领域的应用,并对该技术的应用前景进行了初步展望。

分离技术在新型冠状病毒研究和防疫检测中的应用

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情的爆发给世界公共卫生安全带来前所未有的挑战。随着新型冠状病毒(SARS-CoV-2)相关研究的不断深入,众多分析检测技术相继被应用,推动了病毒检测、疫苗和创新疗法的研发,从而使疫情早日得到控制。分离技术作为生命科学、医学、药学领域的关键技术,操作简单,分离效率高,选择性强,在新型冠状病毒的分离、检测、诊疗及防疫中起到不可替代的作用。该文以SARS-CoV-2或COVID-19为关键词在ISI Web of Science中进行主题检索,归纳了2020年度新型冠状病毒相关的研究论文,简要介绍主要的研究方向,并对国际顶级学术期刊Nature,Science,Cell的论文发表情况进行了统计。通过检索影响因子较高的期刊,综述了新型冠状病毒研究中主要应用的分离技术,并从亲和色谱和尺寸排阻色谱、液相色谱、磁珠分离、离心、微纳分离以及电泳6个方面进行说明。综述统计了亲和色谱和尺寸排阻色谱纯化的病毒相关蛋白,并介绍了其在新型冠状病毒传播、感染机制以及药物筛选中的应用;介绍了液相色谱对病毒候选药物评估以及复杂基质中单一成分的鉴定;介绍了磁珠分离在细胞分离、核酸提取和免疫学检测中的应用;介绍了离心对病毒颗粒、细胞以及血清的分离;介绍了微纳分离结合其他技术以实现病毒蛋白的高灵敏检测;简要介绍了电泳在聚合酶链式反应(PCR)产物分析中的应用。该文综述了2020年度新型冠状病毒研究和防疫检测中分离技术的应用情况,分析了分离技术在新型冠状病毒检测中发挥的作用,旨在为从事分离研究的科研工作者提供一些参考。